肝臟細胞自噬在肝纖維化中的作用研究進展

陳柳，李敏，王曉萍，強磊

(中國藥科大學，江蘇 南京 211198)

肝纖維化是由于細胞間基質蓄積引起的肝臟纖維組織的異常增生。肝纖維化的不完全可逆性可能進一步惡化為早期肝硬化、肝衰竭或肝癌，約10%的肝癌患者將發展演變為惡性肝癌，最終可能導致患者死亡[1-2]。肝纖維化的發生有多種誘因，其中包括：酗酒、病毒(hepatitis B virus,HBV/ hepatitis C virus,HCV)性肝炎、自身細胞免疫性肝炎、非病毒酒精性肝炎和脂肪病毒性肝炎等。肝纖維化的發生是長期慢性肝損傷的一個必然結果，而肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纖維化的中心環節[3]。HSC的激活促進纖維化的轉錄和分泌。近些年研究發現，自噬參與了多種肝臟疾病(包括酒精誘導的肝纖維化、非酒精性脂肪肝以及病毒性肝炎等)的發生過程[4-5]。自噬對肝纖維化的調控是廣泛而復雜的，既具有促進纖維化的作用，也有抗肝纖維化的作用。肝纖維化屬于可逆性病變，雖然人們對其發生、發展機制有了一定的認知，但是自噬在肝纖維化中的作用還不是特別清晰。本文就不同肝細胞自噬在肝纖維化發展中的作用做一綜述。

1 自噬的概述

自噬(autophagy)是維持機體內環境穩態的自身消化代謝過程，可以將胞質中的細胞器、蛋白和大分子等物質分解后再利用[6]。根據細胞成分運輸至溶酶體的方式將自噬分為3種類型：大自噬(macroautophagy，人們通常認為的自噬)、伴侶蛋白介導的自噬(chaperone mediated autophagy,CMA)和微自噬(microautophagy)。巨自噬即狹義的自噬，目前已發現40多種自噬相關基因(autophagy related gene，ATG)，其中有一系列基因與自噬體的形成密切相關(如ATG110、ATG12-14、ATG16、ATG18等)[7]。自噬基本過程是游離膜包裹細胞內需要降解的成分形成吞噬體，吞噬體進一步通過選擇性和非選擇性的途徑招募細胞質成分組裝成自噬小體，自噬小體和溶酶體膜融合形成自噬溶酶體降解膜內包裹的物質。此外，巨自噬過程中還需要p62/SQTM1，beclin1等關鍵蛋白的參與。自噬，參與了發育、衰老、細胞程序性死亡等許多重要的生理過程，在腫瘤、心血管疾病、神經退行性疾病等各種疾病的發病機制中起著十分重要的作用[8]。自噬在肝臟疾病中起著廣泛而復雜的作用，特別是肝纖維化發生發展過程[9]。肝纖維化是持續性肝損傷和肝臟炎癥長期影響的必然結果。肝臟損傷時，HSC受到旁分泌作用轉化為肌成纖維細胞(myo-fibro blaster，MFB)，細胞外基質(extracellular matrix,ECM)增加，細胞外基質在肝臟過度沉積將表現為肝內纖維結締組織異常增生[10]。自噬在肝臟內不同類型的細胞中對肝纖維化的調控作用不同[11](如圖1)。一方面，自噬通過調節肝星狀細胞的脂質代謝和激活肝星狀細胞的活化促進肝纖維化的發展；另一方面，自噬通過調控肝巨噬細胞、肝實質細胞和肝內皮細胞在肝臟炎癥、肝損傷應答和肝臟代謝穩態等細胞功能抑制肝纖維化[12-13]。

圖1 肝細胞自噬在肝纖維化中的特異性功能

肝細胞損傷通過加速炎癥和激活肝星狀細胞(HSC)而引發纖維化。不同肝細胞的自噬在肝纖維化過程中起著復雜的作用。在肝細胞、巨噬細胞和內皮細胞中，自噬間接抑制肝纖維化，①影響脂肪代謝，減少凋亡；②降低IL-1α和IL-1β；③維持內皮細胞的穩態。HSC自噬直接促進肝纖維化。蓄積激活的HSC可促進肝纖維化的發生，ROS和ER損傷可促進肝纖維化的發生，但維生素D受體(VDR)和法尼酯X受體(FXR)可抑制肝纖維化的發生。

2 肝細胞自噬與肝纖維化

2.1 肝星狀細胞自噬 肝纖維化發生過程中，HSC的持續激活是肝纖維化的關鍵環節。肝星狀細胞的活化分為兩個階段：起始階段和拓展階段。初始階段是肝損傷釋放的多種細胞因子作用于HSC，核內轉錄發生一系列的變化激活HSC。拓展階段是激活的HSC獲得了收縮型、趨化型和纖維增生等表型。HSC的激活是一個廣泛而復雜的調控過程，自噬通過影響肝內多種細胞因子的分泌和信號通路調控肝損傷和肝纖維化的發展[8-10]。脂質滴(lipid droplet,LD)耗竭是HSC激活的重要特征[14]。肝星狀細胞自噬促進LD降解，為誘導HSC的活化和增殖提供能量[15-16]。抑制HSC自噬會減慢HSC活化過程，下調HSC分泌細胞外基質(ECM)。HSC特異性敲除Atg7基因的小鼠會減弱對肝損傷的應答反應并促進肝纖維化[17]。而自噬基因Atg5的過表達加速了靜態HSC中LD的降解[17]，促進HSC激活。HSC自噬可促進hedgehog (Hh)信號通路Smo蛋白活性，激活Gli蛋白進入核內調控下游靶基因轉錄。Hedgehog (Hh) 信號通路通過激活靶基因Yes相關蛋白(Yes associated protein,YAP)來調節HSC的祖細胞分化和轉分化[18-20]。肝星狀細胞自噬可能通過轉錄因子YAP調節HSC的分化和轉分化促進肝纖維化的進展。

許多細胞因子或信號通路可促進HSC自噬影響星狀細胞的活化。細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是眾所周知的炎癥誘導劑，可促進HSC和人肝星狀細胞(LX-2)的自噬通量和自噬體形成，從而促進脂質的降解[21]?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)在肝臟中作用廣泛，通過激活HSC自噬影響肝損傷和肝纖維化。ROS上調細胞炎癥因子的分泌。炎癥因子通過促進Ⅰ型膠原蛋白的表達，TGF-β的蛋白水平和基質金屬蛋白酶活性，從而增強大鼠肝纖維化的發展[22]。有研究表明纖維化肝臟富含G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor,GPCR)的配體，大部分可被Gα12偶聯的配體激活。Gα12的過表達增強HSC的自噬，促進ROS的產生和肝臟炎癥反應[23-24]。法尼酯X受體(farnesoid X receptor,FXR)選擇性抑制NF-κB介導的炎癥反應和靜止的HSC活化[25]。FXR抑制自噬以維持甚至增強肝細胞存活。

最新研究表明，慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)患者表達更高的高遷移率族box-1(high mobility group protein box-1,HMGB1)蛋白[26]并誘發過度炎癥反應[27]，促進肝纖維化和癌變的發生。HMGB1-RAGE信號軸被報道調節HSC和肝纖維化的自噬。HMGB1通過激活p-ERK和抑制p-mTOR信號蛋白與RAGE結合，加劇肝纖維的進展。外源HMGB1通過抑制p-STAT3和p-mTOR信號蛋白誘導自噬和活化靜止的HSC，從而分泌更多的HMGB1以增強HMGB1-RAGE軸效應[28-31]。外源性和內源性的HMGB1協同調節HSC激活和肝纖維化。

2.2 肝細胞自噬 肝實質細胞是肝臟中數量最多的細胞，持續性肝損傷通過旁分泌作用激活HSC的活化，促進纖維化過程。肝細胞的基礎自噬通過減少細胞凋亡來保護肝細胞免受炎癥損傷[32]，而肝細胞中的脂自噬產生的游離脂肪酸為氧化反應提供能量[33]。肝細胞特異性自噬缺失小鼠(Alb-Cre/Atg5)與對照小鼠(C57BL/6)相比，肝臟中p62大量積累，并顯示出免疫反應的肝細胞數量減少[34-35]。肝細胞數量減少降低肝細胞對炎癥和損傷反應的耐受性。肝細胞自噬缺失通過WNT信號的激活促進肝實質細胞白介素-6(interleukin 6,IL-6)的分泌，IL-6通過旁分泌途徑激活HSC的活化和促進肝纖維化[36-37]。眾所周知，mTOR激酶負調節自噬[38]。其中AKT-mTOR通路與細胞生長以及肝纖維化，急性肝炎和肝癌的發展密切相關[39]。肝細胞中AKT-mTOR激活通過負調控自噬促進肝纖維化的發展[40]。

脂肪酸氧化作為肝組織和肌肉組織的主要能量來源，在肝臟的代謝平衡中起著重要作用。脂質是脂肪酸的主要來源，肝細胞脂質積累誘導釋放促進HSC活化和增殖的因子，從而增強肝細胞對凋亡的抵抗力，促進肝損傷并抑制肝細胞再生。而肝細胞的自噬活性降低能夠促進脂質累積[41-43]。線粒體作為細胞能量產生和氧化呼吸的場所，影響許多慢性炎性疾病(包括肝纖維化)的發生發展[44]。在哺乳動物細胞中，饑餓和低氧誘導的線粒體自噬協同AMPK信號通路可降低轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的分泌和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達[45-46]。最新的研究發現肝細胞衰老可以促進多種炎癥因子的分泌，例如IL-6，通過“衰老傳染”促進HSC衰老抑制肝纖維化的發展。阻斷肝細胞自噬可通過穩定脂肪代謝以及預防細胞凋亡對肝細胞炎癥反應和肝纖維化起到保護作用。

2.3 巨噬細胞自噬 持續性肝損傷和肝炎是造成肝纖維化進展的主要誘因。肝巨噬細胞是肝組織中天然免疫細胞，其通過細胞因子、清除細胞碎片和抵抗環境壓力引起的過度炎癥來維持肝組織內環境穩態，在肝損傷和肝炎的發展中發揮主導作用[47]。肝巨噬細胞自噬作用通過調節炎性細胞因子[尤其是白介素-1α(interleukin-1 α,IL-1α)和白介素-1β(interleukin 1 β,IL-1β)]的釋放來減少炎性細胞的募集和炎癥反應，抑制肝纖維化的發展[48-49]。髓系細胞自噬基因Atg5的缺失小鼠在長期注射四氯化碳(CCl4)后，提高肝臟中IL-1α和IL-1β的mRNA和蛋白質水平。自噬誘導劑雷帕霉素可抑制巨噬細胞中IL-1α和IL-1β的表達。同時，沉默巨噬細胞中自噬基因Atg5增加了線粒體氧化物(mitochondrion reactive oxygen species,mtROS)的表達并導致線粒體受損，而線粒體的損傷正是肝臟炎癥反應的主要誘因之一[50]。巨噬細胞敲低Atg7基因的表達也發生了類似的趨勢[50-51]。進一步的研究證實，自噬缺失會激活NF-κB通路，這與IL-1α和IL-1β分泌表達密切相關。IKKβ抑制劑ML120b抑制了IL-1α和IL-1β的分泌[52-53]。自噬缺失上調IL-1α和IL-1β的產生與mtROS依賴性NF-κB途徑激活相關。另一個研究結果表明，巨噬細胞炎性因子IL-1α和IL-1β分泌的增加促進中性粒細胞和單核細胞在肝臟聚集，誘導肝細胞的凋亡。巨噬細胞自噬可能通過另一種肝保護機制抑制肝纖維化[49，53]。

最近的研究報道巨噬細胞的衰老通過增加細胞因子分泌，減少吞噬作用和抑制自噬而促進了炎癥因子的表達和分泌[54]。衰老的巨噬細胞不僅能分泌炎癥因子影響肝組織的炎癥反應，同時也能分泌轉化因子TGF-β促進HSC的活化和細胞外基質的合成。衰老抑制了自噬相關基因及其蛋白質(即Atg7、Atg5、Atg4B、Beclin-1和Lamp-2)的表達水平，促進許多炎癥因子的表達和釋放，進一步影響炎癥反應和肝細胞損傷[55]。肝臟衰老引起的巨噬細胞數量增加是自噬依賴的。巨噬細胞自噬在肝臟衰老中引起的炎癥反應和肝細胞損傷起保護作用。

2.4 內皮細胞自噬 肝竇內皮細胞在調節肝竇血流和細胞之間的物質交流提供中樞場所，在維持肝功能的正常運行起到十分重要的作用[56]。內皮細胞自噬可維持內皮細胞氧化能量代謝的穩態，在維持HSC穩態起著重要作用。有報道顯示內皮細胞是能對區域刺激做出快速的局部反應的動態調節器，內皮細胞自噬能穩定它的動態調節功能。在肝損傷期間，內皮細胞選擇性自噬的缺失會加重氧化應激反應從而促進HSC活化[57-58]。肝內皮細胞能夠分泌多種細胞因子，其中包括TGF-β，可直接作用于HSC而促進肝纖維化。少量的ROS和灌注損傷會促進內皮細胞線粒體周圍的自噬通量和LC3的形成[56]，內皮自噬過度激活也會增強小窩蛋白的降解，從而促進肝纖維化的發生[56]。氧化物的含量可能與自噬和纖維化的激活有關，一氧化氮(NO)依賴性通路相互作用的自噬可能影響內皮細胞的表型和功能。肝內皮細胞開放期間，NO依賴性通路通過PI3K-AKT-MTOR通路的減少和窖蛋白-1(Cav-1)的自噬降解的開始而下調，內皮細胞自噬的缺失降低了肝內一氧化氮的生物利用度，削弱了其抗氧化反應[59-60]。肝內皮細胞中敲低自噬基因ATG7的表達增強氧化應激和肝損傷，從而促進肝纖維化[61]。

3 總結與展望

我國是肝病高發地區，大多數的肝病患者都伴隨著肝纖維化的發生，但是目前還沒有有效的抗纖維化治療手段。近年來，細胞自噬研究在肝纖維化中有了一定的進展，細胞自噬在肝纖維化中起著廣泛而復雜的作用[4]。自噬在肝臟不同類型細胞中調控不同的信號通路影響肝纖維化發展過程。肝星狀細胞自噬通過促進脂質代謝促進肝纖維化的發展[14-15]。在肝實質細胞中，基礎自噬具有調節脂肪代謝和減少細胞凋亡影響炎癥反應的雙重作用[46，62]。肝巨噬細胞中的自噬途徑通過抑制炎性細胞因子(尤其是IL-1α和IL-1β)的釋放來減少炎性細胞的募集和炎癥反應，從而抑制肝纖維化[49，62]。內皮細胞自噬主要維持內皮細胞氧化反應和能量代謝的穩態，從而影響其抗氧化反應和炎癥反應[57-58]。綜上所述，自噬是一把雙刃劍。一方面自噬的抗炎和護肝作用使其發揮抑制肝纖維化的效應;另一方面 HSC自噬則使其具有促肝纖維化作用。以自噬為治療靶點特異性靶向不同類型肝臟細胞，也許會為肝纖維化治療過程中提供新的方向。