IL-22BP對腸炎相關性結直腸癌小鼠脾單核細胞和結腸組織炎癥因子表達的影響

葉華，涂云

(1.廣東醫科大學廣東省天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023；2.廣東醫科大學海洋醫藥研究院，廣東 湛江 524023；3.湛江中心人民醫院，廣東 湛江 524023)

炎癥性腸病(包括潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病)是導致結直腸癌發生的高發因素之一。腸炎相關性結直腸癌(colitis -associated colorectal cancer,CAC)的發病模式為“正常腸黏膜→急性炎癥→慢性炎癥→不典型增生→上皮內瘤變→腺癌”，與經典的結直腸癌發病模式并不完全相同。前期的炎癥是CAC發展的先決條件，炎癥因子在其中發揮重要作用。白細胞介素-22(IL-22)是IL-10細胞因子家族的成員，在各種不同的炎癥反應中具有不同的功能，主要取決于所處的炎癥環境[1]。腸道慢性炎癥時，IL-22在腸道組織中長期大量表達，在促進腸道黏膜愈合的同時，也會刺激腸道細胞增殖，從而引發結直腸癌[2]。與IL-10細胞因子家族的其他成員不同，IL-22具有一種可溶性分泌受體，稱為IL-22結合蛋白(IL-22BP)。盡管IL-22BP與IL-22受體1(IL-22R1)具有最高的結構同源性，IL-22BP對IL-22的親和力比IL-22R1高很多，因此可以阻止IL-22與IL-22R1結合。在腸道等多個組織中都觀察到了IL-22BP的組成性表達，并認為可能通過抑制IL-22功能參與調節結腸組織修復和腫瘤的發生[3]，然而IL-22BP如何調節腸炎相關性結直腸癌的作用機制尚不清楚。因此本文建立了腸炎相關性結直腸癌小鼠模型，研究IL-22BP對脾單核細胞和結腸組織干擾素γ(IFN-γ)、IL-17A、IL-22、IL-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～7周齡，體重(20±2)g/只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 試劑及儀器 氧化偶氮甲烷(AOM)購于美國Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS，分子量:36 000～50 000 Da)購于美國MP Bio公司；紅細胞裂解液購于碧云天生物技術有限公司；CD3/CD28抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司；IFN-γ、IL-17A、IL-22、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；組織切片機RM2235(德國Leica公司)；酶標儀(美國寶特Bio-Tek公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立和分組給藥 20只C57BL/6小鼠隨機分模型組和IL-22BP組，兩組小鼠均腹腔注射12 mg·kg-1AOM 1次，1周后先自由飲用2%DSS，連續5 d，然后改為普通潔凈水，連續飲用16 d，此21 d為1個周期，共重復4個周期。IL-22BP組從每個周期的第15天開始腹腔注射IL-22BP 0.2 mg·kg-1，每兩天注射1次，共重復4個周期。第120天頸椎脫臼處死小鼠，收集脾臟和結腸組織，觀察記錄腫瘤形態、數量，計算腫瘤發生率。

1.2.2 結腸組織病理學觀察 小鼠結腸組織用PBS清洗后，濾紙吸干，在結腸遠端取2 cm組織放置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察，區分結腸上皮內瘤變屬于低級別上皮內瘤變(low-grade of intraepithelial neoplasia，LGIN)還是高級別上皮內瘤變(high-grade of intraepithelial neoplasia，HGIN)，同時對結腸進行炎癥評分、黏膜息肉評分和腫瘤評分[4]，根據炎癥、水腫、上皮缺損、隱窩萎縮、增生和不典型增生/腫瘤的評分情況計算得出結腸的組織學活動指數(HAI)。

1.2.3 臟器指數的測定 完整分離小鼠脾臟和結腸，去除脂肪和筋膜后稱重，分別以脾臟和結腸重量(mg)/小鼠體重(g)計算得出脾臟指數和胸腺指數。

1.2.4 脾單核細胞培養 將脾臟剪成1～2 mm組織塊，置于50 μm細胞篩網輕柔研磨。收集到的細胞培養于DMEM培養基(含10%胎牛血清、2 mol·L-1谷氨酰胺、50 U·mg-1青霉素和50 U·mg-1鏈霉素)，使用紅細胞裂解液裂解紅細胞。將細胞按照2.5×106/孔接種到24孔板，加抗CD3/CD28抗體(4 μg·mL-1)在DMEM培養基中培養48 h(37 ℃，10% CO2)，收集上清液80 ℃冷存備用。

1.2.5 ELISA法檢測脾單核細胞和結腸組織IFN-γ、IL-17A、IL-22、IL-6和TNF-α表達 將待測結腸組織與低溫生理鹽水按照1∶9放入勻漿器充分研磨后，于4 ℃以5 000 r·min-1離心5 min，收集上清液備用。按ELISA試劑盒要求操作，于450 nm檢測吸光度。

2 結果

2.1 IL-22BP對CAC小鼠成瘤情況的影響 收集各組小組結腸標本，可見模型組和IL-22BP組小鼠結腸可見不同程度充血水腫增厚，有大小不一的腫瘤出現在腸壁的黏膜面，主要分布在距肛門4～6 cm以內的腸段，腫瘤直徑約2～5 mm，表面光滑、質韌，未見潰瘍及菜花樣改變。與模型組相比，IL-22BP組小鼠腫瘤數量明顯降低，小鼠平均腫瘤數目由(3.6±1.24)減少為(1.6±0.97)個，差異有統計學意義(見表1)。根據WHO分類，輕度和中度異型增生屬于LGIN，重度異型增生和原位癌屬于HGIN，可見模型組腫瘤發生率為100%，其中HGIN 9例，LGIN 1例；IL-22BP組腫瘤發生率為90%，其中HGIN 6例，LGIN 3例，較模型組有所降低。

表1 IL-22BP對CAC小鼠成瘤情況的影響

2.2 IL-22BP對CAC小鼠結腸組織病理學改變的影響 病理結果發現，實驗中誘發的結腸腫瘤為腺癌，在組織學上為高分化管狀腺癌。實驗結束時，對結腸進行炎癥評分、黏膜息肉評分、腫瘤評分和HAI評分，結果見表2顯示，IL-22BP組腫瘤評分和HAI評分均顯著低于模型組，結果有統計學差異(P<0.05)。

表2 IL-22BP對CAC小鼠結腸組織病理學改變的影響

2.3 IL-22BP對CAC小鼠臟器指數的影響 結果見表3，模型組小鼠脾臟指數為4.82±0.59，IL-22BP組小鼠脾臟指數為3.09±0.52，較模型組降低(P<0.05)，差異具有統計學意義；模型組小鼠結腸指數為19.34±1.72，IL-22BP組小鼠結腸指數為15.77±2.09，較模型組降低(P<0.05)，差異具有統計學意義。

圖1 小鼠結腸組織病理學變化

表3 IL-22BP對CAC小鼠臟器指數的影響

2.4 IL-22BP對CAC小鼠脾和結腸組織炎癥因子表達的影響 結果見表4～5，ELISA法檢測IFN-γ、IL-17A、IL-22、IL-6和TNF-α表達，與模型組相比，IL-22BP組脾單核細胞和結腸組織IFN-γ、IL-6和TNF-α水平增高(P<0.05或P<0.01)，IL-17A水平有所降低，IL-22水平無明顯改變。

表4 IL-22BP對CAC小鼠脾單核細胞炎癥因子的影響

表5 IL-22BP對CAC小鼠結腸組織炎癥因子的影響

3 討論

結直腸癌是導致癌癥死亡的第二大因素。結直腸癌的發展是一個多階段的過程，包括致癌物、遺傳改變和宿主免疫系統之間的復雜相互作用，并最終導致癌癥的發生。與肝癌、前列腺癌、胃癌等常見惡性腫瘤相似，慢性炎癥是結直腸癌發展的獨立危險因素，如潰瘍性結腸炎患者結直腸癌發病率顯著增加[5]。對炎癥相關結腸癌發生的研究表明，炎癥細胞衍生的細胞因子直接或間接刺激癌細胞的生長[6-7]。然而，在特定的炎癥條件下，免疫細胞也可以通過清除增生異常細胞和癌細胞的下游效應介導抗腫瘤反應[8]。特別是腸炎相關結直腸癌，表現出廣泛的炎性浸潤，細胞因子在腫瘤微環境中的高表達。

本研究結果表明，IL-22BP可以顯著抑制CAC小鼠腫瘤生長，而且IL-22BP組腫瘤評分和HAI評分均顯著低于模型組。免疫/炎癥細胞控制癌細胞增殖的能力主要取決于細胞因子，其中Th1CD4+細胞、CD8+細胞和NK細胞產生γ干擾素(IFN-γ)，通過激活細胞毒性免疫來限制腫瘤生長[9]。我們觀察到給予IL-22BP后，腸道和脾單核細胞IFN-γ含量均有所提高。

在人類CRC中檢測到，Th17 CD4+細胞產生的腫瘤特異性細胞因子如IL-17A和IL-22表達上調[2,6]。多項研究也證明了這些細胞因子在促進腫瘤發生發展中的重要性，與之相對應的是Th17免疫細胞浸潤對結直腸癌患者的預后有負面影響[10]。我們發現小鼠腹腔注射IL-22BP后，脾單核細胞IL-17A含量有所下降。但是腸道和脾單核細胞IL-22含量沒有明顯改變，說明IL-22BP對腸炎相關性結直腸癌的抑制作用是通過影響IL-22與IL-22R1的結合，對IL-22的表達沒有影響。

細胞因子IL-6和TNF-α對炎癥和癌癥都是至關重要的，它們可以構成一個同時促進炎癥和腫瘤生長的中樞信號通路[11]。臨床研究顯示，結直腸癌患者血清IL-6和TNF-α水平升高，兩者共存水平與預后密切相關[12]。然而在本研究中雖然IL-22BP可以抑制CAC小鼠腫瘤生長，但IL-6和TNF-α含量有所增加。腫瘤微環境中的細胞因子主要由造血細胞產生，但一些細胞因子如IL-6和TNF-α也可由惡性細胞自身產生，以建立一個自分泌腫瘤促進信號回路，進一步增強NF-κB和STAT3的激活。我們推測，在本研究中，由于IL-22的活性被IL-22BP抑制，從而反饋性引起惡性細胞增加IL-6和TNF的分泌。

綜上所述，通過建立腸炎相關結直腸癌小鼠模型，可以觀察到IL-22BP抑制CAC小鼠腫瘤生長，進一步研究脾單核細胞和結腸組織IFN-γ、IL-17A、IL-22、IL-6和TNF-α等炎癥因子表達，發現IFN-γ、IL-6和TNF-α水平增高，IL-17A含量降低，IL-22含量無明顯改變，表明IL-22BP對炎癥因子的作用是一個復雜的網絡調節體系，還需要深入研究。