兩種助劑對溴敵隆毒餌的增效作用研究

姜洪雪，姚丹丹，馮志勇

（廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】嚙齒動物是哺乳動物中種類最多、分布最廣、數量最大的類群，其中一些種類對農業生產、人類健康及公共安全造成巨大危害［1-3］。為控制害鼠，通常采用以生態調控為基礎的綜合治理技術，其中化學防治是極其重要的防控措施。而抗凝血類殺鼠劑是一類慢性化學藥劑，相對比較安全、適口性好、滅鼠效率高，自20世紀80年代，在我國農牧區和城市廣泛使用［4-6］，是當前最主要的殺鼠劑。但是連續使用超過6年的地區陸續報道了鼠類抗藥性的產生，抗藥性、交互抗性和抗性種群的出現，大大降低了滅鼠效果，增加了滅鼠難度和成本［7-9］。而新藥創制難度大，且必須同時滿足“高效、安全、經濟”的特點［10-11］。如何延緩鼠類抗藥性、提高殺鼠劑的利用率、降低殺鼠劑的生態風險成為亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M展】已有研究發現一些藥物等能增強抗凝血劑的作用［12-15］，馮志勇等［14］將增效劑S和增效劑A按照一定比例分別配制成增效滅鼠劑Ⅰ和增效滅鼠劑Ⅱ用于滅鼠試驗，結果表明，復配增效滅鼠劑顯著降低抗凝血滅鼠劑的用量，適口性好、安全性高，不僅對室內試驗的小白鼠和小家鼠控制效果好，而且對農田的鼠類滅效也較高。王俊超等［15］研究發現添加了雙氯芬酸鈉、丙三醇等輔料配制的溴敵隆液劑和粉劑能有效毒殺大白鼠、小白鼠、褐家鼠、大倉鼠和布氏田鼠，適口性良好，既降低了溴敵隆的濃度，又保證了滅效。而在我國南方地區，氣候潮濕多雨，稻谷具有適口性好、保鮮期長和來源廣泛的優點，是農區滅鼠的最適誘餌。但是抗凝血殺鼠劑難溶于水，稻殼對抗凝血殺鼠劑進入米粒具有阻滯作用。張美文等［16］通過生物測定及光譜分析表明，谷殼對敵鼠鈉鹽進入米粒中具有50%左右的阻滯率。鼠類只取食稻谷中的米粒，藥物主要粘附在稻谷表層，殘留在田間、戶外的毒谷和毒殼易造成環境污染及非靶標動物中毒的風險［17-19］?！颈狙芯壳腥朦c】針對稻谷毒餌利用率低、生態風險大的問題，以溴敵隆殺鼠劑的溶解性及稻谷毒餌的特性為切入點，研究農藥助劑如滲透劑對抗凝血殺鼠劑的滲透作用和增效作用，揭示抗凝血劑的增效機制?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬通過篩選助劑增加抗凝血類殺鼠劑的滲透能力，提高稻谷毒餌的利用率，室內生測試驗驗證助劑對抗凝血類殺鼠劑控制小白鼠的增效作用，為科學精準治理鼠害提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試劑：大衛溴敵隆母液（有效成分含量0.5%，商丘市大衛化工廠），溴敵隆標準品（美國AccuStandard公司），色譜純甲醇（美國Fisher公司），乙酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），二甲基亞砜（天津市富宇精細化工有限公司），N, N-二甲基甲酰胺（天津市富宇精細化工有限公司）。

主要儀器：Dionex ultimate 3000高效液相色譜工作站，配熒光檢測器（Dionex，美國），HY-5回旋式振蕩器（常州澳華儀器有限公司），KQ2200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試驗動物：昆明小白鼠，雌雄各半，共154只，于2019年12月購自廣州市黃埔區長勝養殖場。

1.2 試驗方法

試驗于2019年12月至2020年4月在廣東省農業科學院植物保護研究所大豐試驗基地進行。

1.2.1 常規稻谷毒餌及添加助劑后的稻谷毒餌配制方法 0.01%溴敵隆稻谷毒餌：有效成分含量0.5%的溴敵隆母液50 mL兌水200 mL，充分攪拌倒入2.5 kg稻谷中，混勻，待藥液被吸干后，曬干。

0.0025%溴敵隆稻谷毒餌：有效成分含量0.5%的溴敵隆母液5 mL兌水80 mL，充分攪拌倒入1.0 kg稻谷中，混勻，待藥液被吸干后，曬干。

添加1%、2%、4%、8%、24%N,N-二甲基甲酰胺的0.01%溴敵隆稻谷毒餌：準確稱量5、10、20、40、120 mL二甲基甲酰胺，再分別與35、30、20、0、0 mL水混合，再加入10 mL有效成分含量0.5%的溴敵隆母液，混勻后與500 g稻谷攪拌，混合均勻，待藥液吸干后曬干，配制成濃度為1%、2%、4%、8%、24%的N,N-二甲基甲酰胺0.01%溴敵隆稻谷毒餌。不同濃度二甲基亞砜的0.01%溴敵隆稻谷毒餌的配制方法與N,N-二甲基甲酰胺相同。

添加4%N,N-二甲基甲酰胺的0.0025%溴敵隆稻谷毒餌：準確稱取40 mL N,N-二甲基甲酰胺與40 mL水混合均勻，再加入5 mL有效成分含量0.5%的溴敵隆母液，混勻后與1.0 kg稻谷攪拌，再次混勻，待藥液吸干后曬干，配制成濃度為添加4%N,N-二甲基甲酰胺的0.0025%溴敵隆稻谷毒餌。添加4%二甲基亞砜的0.0025%溴敵隆稻谷毒餌的配制方法與該濃度N,N-二甲基甲酰胺相同。

1.2.2 溴敵隆稻谷毒餌樣品前處理 將溴敵隆普通毒谷稻殼與糙米手工分離，分別用粉碎機研磨，過0.250 mm篩。準確稱取1 g殼粉及4 g米粉，置于100 mL具塞離心管中，加入甲醇40 mL，加塞后振蕩15 min，超聲提取15 min，3 000 r/min離心5 min。預先以5 mL甲醇活化中性氧化鋁柱（AL5006-N，Alumina N SPE，500 mg/6mL），棄流出液，分別取殼粉上清液4 mL，米粉上清液5 mL上樣，用10 mL甲醇-乙酸（95:5）溶液洗脫，收集洗脫液，在60℃下用氮氣吹干，再用1 mL甲醇溶解殘渣，過有機濾頭（0.2 μm，13 mm），供高效液相色譜儀測定。添加助劑的毒谷中溴敵隆樣品前處理方法與普通毒谷相同。

1.2.3 添加助劑的毒谷對小白鼠的毒殺作用 選擇成年、健康、非孕、無外傷的個體，雌性36只，雄性38只，稱量體重，采用無選擇定量攝食試驗，單籠飼養。先用稻谷飼養2 d，然后按體重15%提供毒谷連續飼喂小白鼠，每天稱毒谷的消耗量，更換新餌。3 d后，清除毒谷，改用飼料正常飼養，觀察14 d，記錄小白鼠死亡時間，計算死亡率。

1.2.4 添加助劑的毒谷對小白鼠的適口性試驗 選擇成年、健康、非孕、無外傷的個體，雌性41只，雄性39只，稱量體重，采用有選擇攝食試驗，單籠飼養。先用稻谷飼養2 d，然后分別將5 g稻谷和5 g溴敵隆毒谷對角線放入飼養籠內，讓小白鼠自由選擇取食，每天稱稻谷和毒谷的消耗量，更換新餌并交換位置。連續選擇攝食3 d后，清除毒谷，改用飼料正常飼養，觀察14 d，記錄小白鼠死亡時間，計算攝食系數。

1.3 測定指標及方法

（1）毒餌中溴敵隆含量測定方法：采用高效液相色譜法，色譜柱C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器：熒光檢測器，激發波長310 nm，發射波長390 nm；流動相A：水+0.25%乙酸；流動相B：甲醇+ 0.25%乙酸，梯度洗脫：0～5 min，B保持25%，5～20 min，B升高至95%，20～25 min，B由95%升至100%。

（2）添加助劑后毒餌生物測定指標：毒殺試驗中測定毒餌每天的消耗量，計算致死時間及死亡率；適口性試驗中測定無毒餌和毒餌每天的消耗量，計算致死時間及死亡率。

試驗數據采用Excel 2010、SPSS 16.0進行處理和分析，采用LSD最小顯著性差異法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 兩種助劑配制的毒谷糙米中溴敵隆含量

添加不同濃度N,N-二甲基甲酰胺配制的0.01%毒谷與對照（0.01%毒谷）糙米中溴敵隆含量之間有顯著差異（F＝455.064，df＝5，P≤0.001）。添加8%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.01%毒谷糙米中溴敵隆含量最高，但與添加4%N,N-二甲基甲酰胺的無顯著差異，添加助劑后糙米中溴敵隆含量均顯著高于對照糙米中的含量（表1）。

添加不同濃度二甲基亞砜配制的0.01%毒谷與對照（0.01%毒谷）糙米中溴敵隆含量之間有顯著差異（F＝76.887，df＝5，P≤0.001）。添加4%二甲基亞砜配制的0.01%毒谷糙米中溴敵隆含量最高，顯著高于其他處理。除添加1%二甲基亞砜配制的毒谷糙米中溴敵隆含量與對照無顯著差異外，其他濃度二甲基亞砜配制的毒谷糙米中溴敵隆含量均顯著高于對照（表1）。

表1 添加不同濃度N, N-二甲基甲酰胺及二甲基亞砜配制的0.01%毒谷糙米中溴敵隆含量Table 1 Content of bromadiolone in the brown rice of 0.01% poison grins prepared by different concentrations of N, N-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide

表2展示了常規毒谷（0.01%）、低濃度毒谷（0.0025%）及添加兩種助劑配制的低濃度毒谷中溴敵隆的分布。常規毒谷中殼含藥量為88.37 μg/g，占總藥量的92.99%，糙米含藥量為6.66 μg/g，占總藥量的7.01%。低濃度毒谷中稻殼含藥量為21.74 μg/g，占總藥量的95.39%，糙米含藥量為1.05 μg/g，占總藥量的4.61%。4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%毒谷中稻殼含藥量為18.11 μg/g，占總藥量的76.38%，糙米含藥量為5.60 μg/g，占總藥量的23.62%。4%二甲基亞砜配制的0.0025%毒谷中稻殼含藥量為17.99 μg/g，占總藥量的77.39%，糙米含藥量為5.26 μg/g，占總藥量的22.61%。經4%N,N-二甲基甲酰胺及4%二甲基亞砜處理后，0.01%溴敵隆毒谷糙米中藥物含量均顯著提高，比常規的0.01%溴敵隆毒谷分別增加271.17%和163.51%。與低濃度毒谷相比，添加兩種助劑配制的低濃度毒谷中糙米的含藥量顯著提高（4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敵隆毒谷，t＝-10.110，df＝2.038，P＝0.009；4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷，t＝-7.722，df＝4，P＝0.002），分別增加433.33%和400.95%。添加兩種助劑配制的低濃度毒谷之間糙米中含藥量沒有顯著差異（t＝0.488，df＝4，P＝0.651）。

2.2 兩種助劑配制的毒谷對小白鼠的毒殺作用

如表3所示，添加兩種助劑的低濃度毒谷對小白鼠的毒殺效果顯著高于未加助劑的低濃度毒谷（4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敵隆 毒 谷，X2＝19.259，df＝1，P＝0.000；4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷，X2＝15.824，df＝1，P≤0.001），與未加助劑的高濃度毒谷（0.01%溴敵隆毒谷）作用效果相當。平均致死時間，4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷顯著長于0.01%溴敵隆毒谷（F＝12.818，df＝3，P≤0.001），其他處理之間沒有顯著差異，組內雌雄個體沒有顯著差異。由此可見，添加助劑的毒谷具有明顯的毒殺作用和增效作用。

2.3 兩種助劑配制的毒谷對小白鼠的適口性

適口性試驗結果見表4，兩種助劑的毒谷攝食系數表現不同，添加4%二甲基甲酰胺的0.0025%毒谷攝食系數與兩種未添加助劑的對照沒有差異（與0.01%毒谷相比：t＝-0.474，df＝38，P＝0.639；與0.0025%毒谷相比：t＝-1.699，df＝25.899，P＝0.101），而添加4%二甲基亞砜的0.0025%毒谷攝食系數顯著低于兩種未添加助劑的對照（與0.01%毒谷相比：t＝6.301，df＝20.599，P≤0.001；與0.0025%毒谷相比：t＝7.132，df＝23.624，P≤0.001）?？傮w而言，攝食系數均超過0.3的適口性標準，適口性良好，且雌雄之間差異不大。毒殺率結果與毒殺作用試驗結果一致，添加助劑的毒谷毒殺率顯著高于同樣濃度未添加助劑的毒谷（4%N,U-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敵隆毒谷，X2＝32.727，df＝1，P≤0.001；4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷，X2＝ 25.6，df＝1，P≤0.001），與高濃度未添加助劑的毒谷效果相當。平均致死時間，兩種助劑配制的0.0025%溴敵隆毒谷與0.01%溴敵隆毒谷之間無顯著差異。

表2 0.01%毒谷及4%兩種助劑配制的0.0025%毒谷中溴敵隆含量Table 2 Content of bromadiolone in 0.01% poison grains and 0.0025% poison grains prepared by 4% two adjuvants

表3 兩種助劑配制的溴敵隆毒谷的毒殺效果Table 3 Toxic effect of the bromodiolone poison grains with two adjuvants

表4 兩種助劑配制的溴敵隆毒谷適口性試驗結果Table 4 Test result of palatability of the bromodiolone poison grains with two adjuvants

3 討論

殺鼠劑與其他化學農藥不同，必須依賴靶標鼠類取食才能發揮作用，因而毒餌取食效率是關鍵。稻谷是適合南方滅鼠采用的毒餌，鼠類剝殼食米，米中的含量對于藥效起到至關重要的作用，而以往的研究沒有針對稻谷毒餌中溴敵隆含量分布展開研究。相關研究報道發現，敵鼠納鹽在沸水中具有一定的溶解度，通過浸泡法配制稻谷毒餌，經測定米中含有敵鼠鈉鹽含量達到43%，接近一半［16］。本研究結果表明，0.01%溴敵隆毒谷中90%以上的藥量粘附稻殼上，僅7%的含量存在米中，溴敵隆難溶于水，稻殼的阻滯作用導致藥物難以到達米粒中，因此，溴敵隆毒谷的利用率有待提高。

阿斯匹林［20-21］、水楊酸鈉［12］、雙氯苯酸鈉［15］等抗凝血殺鼠劑的增效劑，其增效機制是通過加速動物體內血液循環，加快中毒鼠出血速度，從而達到協同抗凝血的作用。不同于前人對于殺鼠劑增效劑的研究，本研究的目的是針對溴敵隆毒谷糙米中含量偏低這一問題，通過篩選助劑及其適宜的濃度，增加溴敵隆的溶解性和滲透性，提高米粒中的含藥量，從而減低殺鼠劑用量，提高殺鼠劑的利用率。本研究采用的兩種助劑，二甲基亞砜、N,U-二甲基甲酰胺均為用途很廣的優良溶劑，能與水及大部分有機溶劑互溶。通過高效液相色譜熒光檢測，發現4%濃度的兩種助劑滲入米中的溴敵隆含量更高，推斷低濃度的助劑可能滲透力不足，而更高濃度的助劑滲透力已經達到飽和，也可能與其他因素有關。

從實驗室內生物測定結果可見，添加兩種助劑對低濃度的溴敵隆毒谷增效明顯，與常規0.01%濃度相比，添加4%助劑的0.0025%溴敵隆毒谷無論毒殺效果及適口性方面都表現良好，驗證了兩種助劑的滲透能力及增效作用，達到了預期目的。另外，4%助劑用量配制的稻谷單獨飼喂對小白鼠沒有毒性，而且不影響適口性。與協同增效的藥物不同，本研究添加了助劑沒有顯著縮短小白鼠的致死時間，可能與增效機制不同有關，抗凝血殺鼠劑屬于慢性殺鼠劑，助劑的作用仍然保持抗凝血劑的致死機理，但是增加了殺鼠劑在水中的溶解性，提高了殺鼠劑的利用率。類似地，應用于害蟲防治的殺蟲劑，滲透劑類助劑可促進有效組分滲透到靶標生物體內，或者溶解昆蟲體壁的蠟質層，增強藥液透過生物表面的能力，從而提高殺蟲劑的藥效和降低用量［22-23］。

抗凝血殺鼠劑仍然是未來一段時間控制鼠害的重要技術措施，在抗藥性問題日益突出、新藥研制困難的形勢下，通過合理使用抗凝血殺鼠劑增效劑，可以大幅降低殺鼠劑的用量，減少殺鼠劑的生態風險，延緩鼠類對抗凝血殺鼠劑的抗藥性，延長現有抗凝血殺鼠劑的使用壽命。本研究后續將深入開展農田滅鼠試驗及對非靶標生物的安全性試驗，以期獲得更大的經濟效益和社會效益。

4 結論

利用各種農藥助劑可以將農藥活性成分輸送到作物、雜草、害蟲和其他有害生物的靶標位點，使其充分發揮藥效，減少用量，減輕污染。本研究結果表明，經4%N, N-二甲基甲酰胺及4%二甲基亞砜處理后，0.01%溴敵隆毒谷糙米中的藥物含量均顯著提高，添加4%N, N-二甲基甲酰胺和4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷，糙米中的藥物含量也均顯著增加；而且用4%的兩種助劑配制的0.0025%溴敵隆毒谷，對小白鼠均具有較好的適口性及毒殺效果。因此，4%N, N-二甲基甲酰胺或4%二甲基亞砜作為助劑對溴敵隆毒餌均有顯著的增效作用，并可顯著降低殺鼠劑的使用濃度。