水稻細菌性條斑病菌侵染后抗、感近等基因系酶活性的變化

何圣賢，萬 瑤，張 慧，劉 芳

（1.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004；2.廣州南洋理工職業學院經濟管理學院，廣東 廣州 510900）

【研究意義】水稻細菌性條斑病（bacterial leaf streak，BLS，簡稱細條病）是由黃單胞菌稻生致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzicola，Xooc）侵染引起的細菌性病害［1］。細條病在我國是重要的檢疫性病害之一［2-3］，是繼水稻稻瘟病、水稻紋枯病和水稻白葉枯病后第四大病害［4］。病原菌侵染植物后，植物體內將會激發相關的防御反應，而一系列保護酶活性的變化對植物自身抵御外來侵害發揮著重要作用［5］。因此，研究水稻感染細條病菌后酶活性的變化可為揭示水稻與病原菌互作機制提供依據，同時為水稻抗性育種提供參考。【前人研究進展】Shikanai等［6］發現煙草葉綠體中導入大腸桿菌的CAT基因，在光照強輻射即干旱脅迫下，轉基因植物光合作用的耐光性明顯高于對照；Polidoros等［7］發現煙草中轉入玉米CAT2基因，可以增強煙草對細菌的抑制能力，盡管過氧化氫酶（CAT）活性增加不顯著；劉建寧等［8］選用抗旱性有差異的牧草幼苗作為材料，在0～72 h內測定其內部CAT活性，發現抗旱性弱材料體內的CAT活性大多時間低于抗旱性強材料；周明華等［9］通過對細條病侵染水稻抗感品種研究，發現苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性與品種抗性呈負相關，原因尚待研究；李云鋒等［10］發現過氧化物酶（POD）及PAL活性與植物的抗病性呈正相關，此指標可為植物抗性高低作鑒定，進而說明POD、PAL在植物抵抗病原菌過程中發揮重要作用；張曉葵等［11］通過研究細條病侵染抗感材料體內POD活性變化，發現感病品種POD活性下降，而抗性品種POD活性增強。王樹彬等［12］研究表明，水稻葉片被細條病菌感染后感性品種葉片內CAT、SOD（超氧化物歧化酶）活性下降明顯，POD活性略有上升，而抗病品種葉片內CAT、POD、SOD活性均顯著上升。劉福等［13］研究發現，叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）侵染易感黃萎病品種軍棉1號后，丙二醛（MDA）含量受到抑制。目前，關于酚類物質與抗病性的關系研究結果尚無統一定論，如鈴木直治［14］認為酚類物質酶活性變化與抗性不同的材料無直接影響，而周潔等［15］研究證明酚類物質酶活性與抗病性之間的關系成正相關。【本研究切入點】雖然在水稻與病原菌互作過程中植物酶活性的研究已取得一定進展，但對于各類植物酶在水稻抵抗細條病菌中所發揮的作用，還缺乏認識，關于Xooc侵染后抗、感近等基因系植株酶活性的變化仍少見報道。【擬解決的關鍵問題】通過測定Xooc侵染水稻細條病抗、感近等基因系后MDA含量以及CAT、PAL、POD、PPO（多酚氧化酶）和SOD在不同時間點葉片內的活性，明確Xooc侵染對水稻體內主要保護酶活性的影響，為研究和防治水稻細條病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以感病秈稻品種9311為輪回親本，抗病野生稻材料DY19為供體親本，通過雜交、回交和自交培育BC4F3代，獲得水稻細條病抗病近等基因系LR19和感病近等基因系LS19。2019年9月種植LR19和LS19各100株于廣西大學農學院科學研究試驗基地。

供試菌株：水稻細條病菌（Xooc）采用廣西水稻細條病優勢生理小種 GX01，由廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室何勇強教授提供。

主要儀器和試劑：TGL-2150臺式微量高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）、ELx405Select深孔板酶標儀、島津UX620H電子天平、G9系列紫外可見分光光度計（上海讓奇儀器科技有限公司）、上海精宏DK-S26雙列六孔電熱恒溫水浴鍋、TG16臺式高速臺式離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、格瑞斯BD200-UL電解液移液器、石英比色皿（宜興市晶科光學儀器有限公司）、研缽（北京豫維科技有限公司）、冰和蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣與接種 水稻種植采用盆栽法，盆大小為 60 cm×40 cm，每盆10行，每行10株，抗、感病近等基因系間行排列。做好水肥管理及病蟲害防治工作，待材料長至分蘗期時接種取用。接種時選擇生長較一致的葉片，每隔2～3 cm接種1對針刺點，取樣時取3片這樣接種的一整片葉片。于接種后0、24、48、72、96 h從接種Xooc（處理）和接種無菌水（對照）的植株上取樣，樣品做好標記保存于-80 ℃冰箱中。LS19-Xooc：LS19接種Xooc；LS19-CK：LS19接種無菌水（對照）；LR19-Xooc：LR19接種Xooc；LR19-CK：LR19接種無菌水（對照）。

1.2.2 項目測定 樣品采集后，采用北京索萊寶科技有限公司酶活測定試劑盒說明書進行粗酶液提取：0.1 g 水稻組織→1 mL提取液冰浴→8 000 r/min4 ℃離心10 min→取上清待測。按照試劑盒操作說明書步驟分別對CAT、MDA、PAL、POD、PPO、SOD在相應波長處的吸光值進行測定并計算，3次重復。

使用Excel 2019對數據進行整理，利用SPSS 22.0軟件進行方差分析和t測驗。

2 結果與分析

2.1 LR19和LS19受Xooc侵染后CAT活性變化

由圖1可知，LR19和LS19在接菌0 h葉片內CAT活性分別為229.4、114.67 U/g，前者為后者的2倍，二者差異顯著。接菌后0～96 h兩個近等基因系CAT活性整體呈先升高后降低的趨勢，且LR19始終高于LS19。接菌后0～48 h，LR19葉片內CAT活性迅速升高，達到峰值（336.37 U/g），較對照（179.34 U/g）增加87.56%；接菌后48～96 h，CAT活性隨著時間延長而減少，接菌后96 h較對照（157.35 U/g）增加59.59%，差異顯著；接菌后0～48 h，LS19葉片內CAT活性一直保持較高上升速率，在接菌48 h達到峰值（172.65 U/g），較對照（71.33 U/g）增加142.04%，差異顯著；后期呈緩慢下降趨勢，較對照（65.26 U/g）增加159.2%。綜上所述，XooC侵染誘導抗、感病近等基因系后葉片內CAT活性增加，且前者的CAT活性始終高于后者，表明CAT活性與細條病抗性呈正相關。

圖1 LR19和LS19受Xooc侵染后葉片內CAT活性變化Fig.1 Changes of CAT activity in leaves of LR19 and LS19 infected by Xooc

2.2 LR19和LS19受Xooc侵染后MDA含量變化

由圖2可知，LR19和LS19在接菌0 h葉片內MDA含量存在差異，分別為16.02、35.27 nmol/g，后者是前者的2.2倍。接菌后0～96 h，二者MDA含量整體呈下降趨勢，且LR19大多低于LS19。LR19接菌后葉片內MDA含量減少，接菌后48 h MDA含量為4.90 nmol/g，較對照（20.39 nmol/g）減少75.97%，差異顯著；接菌后48～96 h，MDA含量呈升高趨勢，但總體仍低于對照，而對照葉片內MDA含量則趨于穩定；LS19接菌后葉片內MDA含量降低較快；接菌后48 h MDA含量為6.49 nmol/g，較對照（25.55 nmol/g）減少74.6%，差異顯著；接菌后48～96 h呈升高趨勢，接菌后96 h MDA含量達到10.6 nmol/g，較對照（22.52 nmol/g）減少52.93%，差異顯著。綜上所述，Xooc侵染導致抗、感病近等基因系后葉片內的MDA含量降低，且前者含量總體上低于后者，表明MDA含量積累與細條病抗性呈負相關。

圖2 LR19和LS19受Xooc侵染后葉片內MDA含量變化Fig.2 Changes of MDA content in leaves of LR19 and LS19 infected by Xooc

2.3 LR19和LS19受Xooc侵染后PAL活性變化

由圖3可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片內PAL活性分別為30.5、27.2 U/g，差異不顯著。接菌后0～96 h，抗、感近等基因系葉片內PAL活性均呈先升高后降低趨勢，總體均表現升高。LR19接菌后0～48 h，PAL活性迅速升高并達到峰值（46.83 U/g），較對照（30.83 U/g）增加51.9%，差異顯著，接菌后48 h PAL活性下降但總體仍高于0 h；LS19接菌0～48 h，PAL活性呈升高變化，接菌后48 h較對照葉片增加23.74%，后期開始緩慢下降，但仍高于對照，接菌后96 h較對照增加15.28%。綜上所述，Xooc侵染誘導抗、感病近等基因系中PAL活性增強，且前者增強的幅度高于后者，表明PAL活性的增強有助于提高細條病抗性。

2.4 LR19和LS19受Xooc侵染后POD活性變化

由圖4可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片內POD活性分別為19 502、17 150 U/g，但差異不顯著。接菌后0～96 h，抗、感近等基因系POD活性整體均表現為先升高后降低趨勢，LR19始終高于LS19。接菌后0～48 h，LR19葉片內POD活性迅速上升，接菌后24 h，POD活性為34 741 U/g，較對照（24 108 U/g）差異顯著；接菌后48 h POD活性達到峰值（38 752 U/g），較對照（15 876 U/g）增加144.09%，差異顯著，接菌后48～96 h，POD活性表現為下降趨勢，但仍高于對照；LS19接菌后0～48 h葉片內POD活性亦開始升高，接菌后24 h，POD活性為23 633 U/g，較對照（9 359 U/g）差異顯著；接菌后48 h，POD活性升到峰值（34 496 U/g），較對照（5 716.7 U/g）增加503.43%，后期緩慢下降至31 262 U/g，較對照（9 800 U/g）增加219%，差異顯著。綜上所述，Xooc侵染誘導抗、感病近等基因系后葉片內的POD活性增加，且前者的POD活性始終高于后者，表明POD活性的增強有助于提高細條病抗性。

圖3 LR19和LS19受Xooc侵染后葉片內PAL活性變化Fig.3 Changes of PAL activity in leaves of LR19 and LS19 infected by Xooc

圖4 LR19和LS19受Xooc侵染后葉片內POD活性變化Fig.4 Changes of POD activity in leaves of LR19 and LS19 infected by Xooc

2.5 LR19和LS19受Xooc侵染后PPO活性變化

由圖5可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片內PPO活性分別為81.0、59.7 U/g，前者是后者的1.36倍。接菌后0～96 h，抗、感病近等基因系葉片內PPO活性呈先迅速上升后緩慢下降趨勢，且抗病系始終高于感病系。LR19接菌后0～24 h PPO活性迅速升高并達到峰值（124.2 U/g），較對照（84.35 U/g）增加47.24%，差異顯著；接菌24～96 h，PPO活性緩慢下降，仍高于對照；接菌后0～48 h LS19 PPO活性呈升高變化，48 h達到峰值（106.5 U/g），后期開始緩慢下降，但仍高于對照；接菌后96 h，PPO活性為98.5 U/g，較對照（58.7 U/g）增加67.8%，差異顯著。綜上所述，Xooc侵染誘導抗、感病近等基因系后葉片內的PPO活性增加，且前者的PPO活性增加較快，表明PPO活性的增強有助于提高細條病抗性。

圖5 LR19和LS19受Xooc侵染后葉片內PPO活性變化Fig.5 Changes of PPO activity in leaves of LR19 and LS19 infected by Xooc

2.6 LR19和LS19受Xooc侵染后SOD活性變化

由圖6可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片內SOD活性差異不大，分別為976.53、840.20 U/g。接菌0～96 h，LR19葉片內SOD活性迅速升高，并整體保持在較高水平，而LS19葉片內SOD活性呈波動變化，但總體仍高于對照。接菌0～96 h，LR19的SOD活性始終高于LS19。接菌0～24 h，LR19葉片內SOD活性迅速升高至2 362.43 U/g，較對照（1 217.94 U/g）增加93.97%，接菌后48 h，SOD活性達到峰值（2 389.79 U/g），較對照（1 217.94 U/g）增加155.48%；接菌后48～96 h，SOD活性下降速率變快，仍高于對照；接菌后0～24 h，LS19葉片內SOD活性迅速升高；接菌后24 h，SOD活性為1 531.88 U/g，較對照（648.4 U/g）增加136.26%，差異顯著；接菌后24 h，葉片內SOD活性呈下降趨勢，仍高于對照；接菌后48～96 h，SOD活性升至1 824.51 U/g，較對照（571.75 U/g）增加219.11%，差異顯著。綜上所述，Xooc侵染誘導抗、感病近等基因系后葉片內的SOD活性增加，且前者SOD活性始終高于后者，表明SOD活性的增強有助于提高細條病抗性。

圖6 LR19和LS19受Xooc侵染后葉片內SOD活性變化Fig.6 Changes of SOD activity in leaves of LR19 and LS19 infected by Xooc

3 討論

植物的防衛機制形成是在相關保護酶催化下一系列復雜生理生化代謝的結果［16］。盡管國內外許多學者深入研究了植物防御酶活性與抗病性的關系，可根據寄主與病原物互作體系不同，得出結論亦略有差異［17-18］。CAT是一種抗氧化酶，其活性在植物受到病原菌侵染時會發生變化，可用作衡量植物抗性反應的重要指標［19］。侯茜等［20］在西瓜幼苗根系防御酶活性變化與枯萎病抗性的關系的研究中，發現CAT活性與植物的抗病性呈正相關；孫正祥等［21］在內生菌 XG-1對西瓜枯萎病誘導抗性的研究中發現植物的抗病性與CAT息息相關。本研究對水稻抗、感近等基因系接種細條病菌后可知，抗、感材料在受到細條病菌侵染后，二者CAT活性均顯著提高。該結果與魏滟潔等［22］在研究球毛殼菌與枯草芽孢桿菌組合侵染黃瓜后CAT活性變化結果一致。

MDA是膜脂過氧化反應過程中生成的的最終產物之一。江彤等［23］發現在煙草上接種黑脛病菌后抗性品種的MDA含量明顯高于感病品種，且高于對照；孔祥華等［24］研究發現炭疽葉枯病菌誘導不同蘋果種質中抗病品種富士MDA含量高于感病品種秦冠，且二者總體均表現升高趨勢；而姚懷蓮［25］在西瓜枯萎病抗性遺傳及生理生化基礎研究中發現MDA與抗性呈負相關。本研究結果表明，水稻抗、感近等基因系受到細條病菌侵染后，抗、感材料體內MDA含量均呈下降趨勢，且感性材料的MDA含量高于抗性材料，表明MDA含量與水稻抗病性呈負相關。林英等［26］也得出相似結論。

PAL在植物抗病性物質生成途徑即苯丙烷類代謝途徑過程中既是限速酶也是關鍵酶［27］，其活性增強對抗性物質木質素含量增加非常有利［28］；其在植物抗病蟲害反應中發揮重要作用，不僅參與植物抗病脅迫反應中相關物質的合成與積累，也是苯丙烷類代謝途徑中最重要的酶，是衡量植物抗病反應過程中重要的生化指標［29-30］。本研究通過研究水稻抗、感近等基因系受細條病菌侵染后PAL活性變化發現，接種后抗、感材料PAL活性均顯著升高，且抗性材料的升高幅度高于感性材料，表明PAL與水稻抗病性呈正相關。這與周東興等［31］在研究番茄枯萎病生防細菌侵染番茄后PAL活性變化結果一致。

POD在植物體內普遍存在，是參與酚類物質、植保素及木質素合成的氧化還原酶，不僅參與植物代謝調節，且在植物抗病過程中發揮重要作用［32-33］。植物在受到病原菌侵染后，其體內活性氧代謝平衡遭受破壞，過多的活性氧不僅會破壞細胞結構使代謝系統紊亂，甚至會使植物細胞死亡［34］，而POD是植物體內擔負清除活性氧的關鍵酶［35］。本研究發現，細條病侵染水稻抗、感近等基因系后，抗性材料的POD活性增幅均顯著高于感性材料，表明POD活性變化與水稻抗病性呈正相關關系。這與關峰等［36］研究結果相同。

植物的抗病性強弱一方面在于體內抗性基因是否表達，另一方面是基因表達后抗病反應的速度及抗病物質積累數量［37-38］。PPO氧化作用產生的醌類物質，如咖啡酸、綠原酸等是有效的殺菌物質，可使毒素失活或抑制病原菌毒素產生。同時，PPO是氧化生物體內酚類物質的主要酶類［39］，邵正英等［40］以鏈霉菌JD211侵染水稻葉片，發現葉片受侵染后其體內PPO活性增強。本研究結果發現，水稻抗、感近等基因系受細條病菌侵染后PPO活性均呈升高趨勢，抗性材料PPO活性顯著高于感性材料。表明PPO活性的增強有助于提高抗病性。這與劉戈輝等［41］研究表達GhB301基因煙草和野生型煙草受到棉花枯萎病菌侵染后PPO活性變化的結果一致。

SOD屬于植物抗氧化酶類，使活性氧的代謝水平維持平衡而防止過多活性氧產生對正常細胞造成不可逆的損傷［42］，其在植物的抗逆境脅迫過程中起到重要保護作用［43］。任平等［44］通過研究獼猴桃植株接種獼猴桃潰瘍病P-L菌株后SOD活性的變化發現，獼猴桃植株的抗病性與SOD活性的變化呈正相關關系。陳亮等［45］選用抗性材料PI296341-FR和感性材料Sugar Baby，分別接種西瓜枯萎病菌，發現SOD活性變化與西瓜抗病性密切相關，在抗西瓜枯萎生理活動中發揮著重要作用。本研究對抗、感近等基因系接種細條病菌后發現，抗感材料的SOD活性均升高，且抗性材料SOD活性始終高于感性材料，表明SOD活性與抗病性呈正相關，與前人研究一致。

4 結論

細條病菌侵染后，抗、感近等基因系CAT、PAL、POD、PPO、SOD活性均增強，且抗性近等基因系的活性始終高于感性近等基因系，表明這5種酶活性的增強有助于提高細條病抗性。細條病菌侵染會導致抗、感近等基因系中MDA含量降低，且抗性近等基因系的含量低于感性近等基因系，表明MDA含量的積累與細條病抗性呈負相關。因此這些酶的活性可以作為水稻細條病抗性鑒定的輔助評價指標。