鈾脅迫對不同苔蘚生長及抗氧化系統的影響

李俊柯，杜家豪，鄧章軒，羅中旭，賴金龍,2，羅學剛,2

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學生物質材料教育部工程研究中心，四川 綿陽 621010）

【研究意義】鈾（Uranium，U）是一種具有高放射性和長半衰期的典型工業污染物［1］，其作為一種天然放射性核素，在地殼中的平均含量為2×10-4%（WT），在巖石、土壤、水和生物體中平均含量約為4 mg/kg［2］。鈾在自然界中有3種放射性同位素（U-234、U-235和U-238），其中U-238豐度最高（99.27%），半衰期達到4.51×109年［3］。由于人類活動，如采礦、磷酸鹽加工、核工業和農業施肥，大量的鈾被釋放到環境中［4］。例如，鈾尾礦和排放水中的鈾濃度分別達到400～41 598、0.244-35.7 Bq/L［5］。研究表明，鈾作為一種非必需和有毒的放射性核素，化學毒性風險高于輻射毒性風險，其通過食物鏈進入生物體，攝入時具有持續的化學毒性，因而對生物體和人類健康有極大的損害。

【前人研究進展】研究者根據鈾在環境中的生物地球化學特性，開發了一些鈾修復技術——物理、化學和生物技術［6］。其中，生物修復特別是植物修復，具有原位修復、應用方便、成本低等特點，是一種理想的修復方法。在植物修復中，鈾積累植物如蕓苔屬［7］、向日葵［8］和黑麥草［9］，都種植在鈾污染地區，通過根從土壤中提取鈾，鈾能隨時間從土壤中移除。然而，鈾礦山一些裸巖、砂石地形土壤殘存量少，大多數高等植物無法生長，成為鈾礦山植物修復的難題。苔蘚植物作為鈾礦山生態修復的先鋒植物，在生態系統中的廣泛分布使其占有重要地位［10］。苔蘚植物能適應土壤殘存量少的地形，能在其他植物無法生存的鈾礦山荒漠化、石漠化土地上生長，同時，加速巖石風化成土的過程，進一步導致巖石分解、土層增厚、有機質增加，具有較強的蓄水保水、水土保持及防風固沙能力，而且在改善土壤理化性質、提高土壤抗沖性及抗雨滴賤蝕等方面具有十分顯著的作用［11］。因此，苔蘚結皮對于鈾礦山生物修復具有極大潛力。然而，鈾往往對植物體有嚴重的毒害作用，有研究表明，鈾已對植物造成明顯的毒害癥狀，包括植物生長緩慢、根系壞死、降低光合速率等［12］，從而大大降低鈾礦山植物修復的效率。因此，研究苔蘚植物對鈾的耐受性及抗性機制，是評價苔蘚結皮用于鈾礦山生態修復可行性的關鍵。

【本研究切入點】為了探究鈾對苔蘚生長及抗氧化系統的影響，本研究選用3種易生長、耐旱、荒石漠化常見優勢苔蘚——大灰蘚（Hypnum plumaeforme）、大灰蘚小型變種（Hypnum cupressiformeL.ex Hedw.var.cupressiforme）、砂蘚（Racomitrium canescensHedw.）作為研究對象。采用條件易控、環境誤差小的溶液培養法處理苔蘚植物。【擬解決的關鍵問題】觀察鈾脅迫對苔蘚生長的影響，測定苔蘚鈾的累積量，闡明苔蘚抗氧化系統對鈾脅迫的適應機制，評價苔蘚植物對鈾的耐受性，為鈾礦山苔蘚結皮生態修復提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用大灰蘚、大灰蘚小型變種、砂蘚作為供試材料，采集于西南科技大學路旁樹蔭下、水渠邊及山坡上，采集后選取生長良好、長勢基本一致的苔蘚，用去離子水培養3 d，待生長正常且生長狀況基本相同時進行鈾脅迫處理。

1.2 試驗方法

根據苔蘚對鈾污染的敏感性，鈾脅迫濃度設置為0（對照）、5、10、15、20 μmol/L。鈾源使用硝酸鈾酰（238U，UO2（NO3）2·6H2O），以1/2霍格蘭營養液配制含鈾處理液（pH=5.5）。鈾脅迫處理72 h后，記錄苔蘚植株生長狀態，測定不同鈾濃度處理3種苔蘚可溶性蛋白、游離脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）含量，過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性以及苔蘚中鈾含量。1/2霍格蘭營養液成分包括：101.1 mg/L KNO3，236.15 mg/L Ca（NO3）2·4H2O，98.59 mg/L MgSO4·7H2O，16.01 mg/L NH4NO3，13.61 mg/L KH2PO4，鐵鹽溶液（1.345 mg/L Na2-EDTA和1.112 mg/L FeSO4·7H2O），以及微量元素（含0.569 mg/L H3BO3、0.356 mg/L MnCl2·4H2O、0.043 mg/L ZnSO4·7H2O、0.01 mg/L CuSO4·5H2O、0.018 mg/L H2MoO4·H2O），pH值為5.5。人工氣候箱培養條件為：溫度25 ℃，空氣相對濕度80%～85%，光照強度為3 500 lx，光照時間12 h。

1.3 苔蘚生長及鈾含量分析

鈾脅迫處理后，采集苔蘚葉片，選取長勢一致的苔蘚植株，用濾紙擦干植株表面水分，采用數碼顯微鏡對苔蘚植物莖尖與假根進行拍照，觀察鈾處理后苔蘚植物的生長狀況。

鈾含量測定：樣品85℃烘干至恒重，用微型植物粉碎機將樣品粉碎并過孔徑0.075 mm樣品篩，每個樣品取0.25 g，重復3次，采用Niton XL3 X射線熒光分析儀測定鈾含量。

1.4 逆境生理指標分析

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法（G-250）［13］測定，Pro含量采用3%磺基水楊酸法［14］測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法［14］測定。

SOD、POD、CAT活性采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒處理。酶粗液個提取方法如下：將采集后的植株編號，每個處理取0.1 g鮮葉片于預冷的研缽中，加入0.1 mol/L冷磷酸緩沖液（pH=7.0）1 mL和少量石英砂，冰浴研磨，勻漿后用0.01 mol/L冷磷酸緩沖液（pH=7.0）5 mL沖洗，并轉移至離心管，3 500 r/min離心10 min，上清液即為酶粗提取液，將酶液轉移至試管，4℃冷藏保存，備用。將處理后的酶粗液按各試劑盒說明書操作表要求分別測定SOD、POD和CAT活性。

生物富集系數（BCF）［15］=植物干物質中重金屬含量（mg/kg，DW）/重金屬濃度（mg/kg，DW）

試驗數據采用SPSS 20.0 軟件進行差異顯著性分析，采用Excel軟件及Origin 2017制圖，不同處理間的方差分析采用二因素有重復實驗分析方法，多重比較采用Tukey多重比較法。

2 結果與分析

2.1 不同苔蘚生長狀態及鈾累積特性分析

由圖1可見，鈾脅迫72 h后，3種苔蘚植物受到不同程度的鈾毒害。空白對照大灰蘚呈綠色，莖尖呈闊披針形，葉緣平展寬大，假根粗大，呈黑色或褐色。大灰蘚莖尖在低濃度（5 μmol/L）鈾脅迫下無明顯變化；而在中高濃度（10～20 μmol/L）鈾脅迫下，莖尖顏色漸黃；當鈾濃度達到20 μmol/L時，其莖尖呈黃褐色，葉緣萎縮偏小，假根在鈾脅迫下無明顯變化。空白對照大灰蘚小型變種植物體呈綠色，枝葉與莖葉同形，外展細小，假根細小，呈黑褐色，其莖尖在高濃度（15～20 μmol/L）鈾脅迫下由綠色逐漸變黃，莖葉收縮，與空白對照相比變小，其假根在鈾脅迫下無明顯差異。空白對照砂蘚中肋較粗，突出葉尖成綠色毛狀刺，假根呈黑色。砂蘚莖尖在鈾濃度為5～15 μmol/L脅迫下變化不明顯，而在鈾濃度為20 μmol/L時莖尖顏色變黃變黑，假根無明顯差異。

如圖2所示，隨著鈾濃度的增加，3種苔蘚植物體內鈾累積量均顯著上升，鈾累積能力表現為大灰蘚小型變種＞大灰蘚＞砂蘚。當鈾處理濃度為20 μmol/L時，3種苔蘚鈾累積量分別為3 440.67、2 410.67、906.33 mg/kg（DW）。由表1可知，大灰蘚BCF最大值出現在鈾濃度5 μmol/L時，為0.37；大灰蘚小型變種BCF最大值出現在鈾濃度20 μmol/L時，為0.43；砂蘚BCF隨鈾濃度增大而減小，最大值出現在鈾濃度5 μmol/L時，為0.25。結果表明，大灰蘚小型變種對鈾有較強的富集能力，而砂蘚對鈾的富集能力較弱。

圖1 鈾脅迫下3種苔蘚生長局部狀況Fig.1 Growth of three bryophytes under uranium stress

圖2 3種苔蘚對鈾的累積特性Fig.2 Accumulation characteristics of Uraniun in three bryophytes

表1 不同濃度鈾處理苔蘚生物富集系數Table 1 BCF of bryophytes under different concentrations of uranium

2.2 鈾脅迫對苔蘚植物可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是重要的滲透調節物質和營養物質，能衡量植物是否受到重金屬脅迫。圖3結果顯示，3種苔蘚可溶性蛋白含量隨鈾濃度的增加均表現為“低促高抑”。大灰蘚可溶性蛋白含量在鈾濃度為15 μmol/L時達到最大值，為13.05 mg/g（FW），且不同濃度梯度其可溶性蛋白含量存在顯著差異。大灰蘚小型變種可溶性蛋白含量在鈾濃度為10 μmol/L時達到最大值（10.7 mg/g，FW）。砂蘚可溶性蛋白含量在鈾濃度為10 μmol/L時達到最大值，為14.84 mg/g（FW）。結果表明，低濃度鈾脅迫促進苔蘚植物可溶性蛋白合成，高濃度鈾脅迫使其可溶性蛋白合成受到抑制。

當植物體受到逆境脅迫時，可通過積累脯氨酸來提高植物的耐逆性。由圖4可知，鈾脅迫使3類苔蘚植物體內游離脯氨酸含量產生了顯著變化。對大灰蘚而言，鈾濃度與其游離脯氨酸含量呈正相關，鈾濃度為0～10 μmol/L時，其對應脯氨酸含量無顯著差異，而在鈾濃度為10～20 μmol/L時，其對應脯氨酸含量存在顯著差異。對大灰蘚小型變種，隨著鈾濃度增加，其脯氨酸含量先增大后減小，在鈾濃度為15 μmol/L時達到最大值（9.88 μg/g，FW）。砂蘚植物體內游離脯氨酸含量隨鈾濃度增加呈現先升后降的趨勢，在鈾濃度為10 μmol/L時達到最大值、為7.12 μg/g（FW）。結果表明，在鈾脅迫下，細胞內會產生脯氨酸來調節細胞滲透平衡，抑制鈾進入細胞中。而高濃度的鈾對苔蘚植物產生嚴重的毒性現象，破壞其細胞結構，抑制蛋白質合成，使得植物體內無法大量產生脯氨酸，導致其含量降低。

圖3 鈾脅迫對3種苔蘚可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of uranium stress on soluble proteins in three bryophytes

圖4 鈾脅迫對3種苔蘚脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of uranium stress on proline contents in three bryophytes

2.3 鈾脅迫對苔蘚植物MDA含量的影響

丙二醛（MDA）是細胞膜脂過氧化反應的產物，植物中MDA含量的多少說明植物細胞膜受到傷害的程度。從圖5可以看出，3種苔蘚植物體內MDA含量均隨鈾脅迫濃度的增加逐漸增大。方差分析表明，大灰蘚MDA含量在各鈾濃度0～10 μmol/L和15～20 μmol/L處理間存在顯著差異，而在10～15 μmol/L間不存在顯著差異。而大灰蘚小型變種與砂蘚MDA含量在各鈾濃度處理間0～10 μmol/L不存在顯著差異，而在10～20 μmol/L間存在顯著差異。結果表明，大灰蘚對于低濃度鈾脅迫反應快于大灰蘚小型變種與砂蘚。

圖5 鈾脅迫對3種苔蘚MDA含量的影響Fig.5 Effects of uranium stress on MDA contents in three bryophytes

2.4 鈾脅迫對苔蘚植物抗氧化酶系統的影響

圖6 鈾脅迫對3種苔蘚POD、SOD、CAT活性的影響Fig.6 Effects of uranium stress on activities of POD,SOD and CAT in three bryophytes

過氧化物酶（POD）作為活性氧酶促清除系統的重要酶類，能有效清除植物體內過氧化氫。結果（圖6）顯示，隨著鈾濃度的增加，3種苔蘚的POD活性先增大后減小。大灰蘚在鈾濃度為5 μmol/L時POD活性達到峰值，為334.42 U/g（FW），各濃度處理間均差異顯著。大灰蘚小型變種在鈾濃度為15 μmol/L時POD活性達到峰值，為436.29 U/g（FW）。砂蘚在濃度為15 μmol/L時POD活性達到峰值，為271.75 U/g（FW）。SOD也是一種抗氧化保護酶。由圖6可見，隨著鈾濃度水平的升高，3種苔蘚 SOD活性呈現先增后降的趨勢。大灰蘚在濃度為5 μmol/L時 SOD活性達到峰值，為421.75 U/g（FW），各濃度處理間均差異顯著。大灰蘚小型變種在鈾濃度為15 μmol/L時 SOD 活性達到峰值，為470.05 U/g（FW），各濃度處理間均差異顯著。砂蘚在鈾濃度為10 μmol/L時SOD活性達到峰值，為493.06 U/g（FW），鈾處理濃度在10～15 μmol/L間SOD活性無顯著差異，其余各處理間均差異顯著。隨著鈾濃度的升高，3種苔蘚CAT活性呈現先增后降的趨勢。大灰蘚在鈾濃度為5 μmol/L時CAT活性達到峰值，為8.40 U/g（FW），各濃度處理間差異顯著。大灰蘚小型變種在鈾濃度為15 μmol/L時CAT 活性達到峰值，為4.92 U/g（FW），鈾處理濃度在0～5 μmol/L間CAT活性無顯著差異，其余各處理間差異顯著。砂蘚在鈾濃度為15 μmol/L時CAT活性達到峰值，為6.86 U/g（FW），各濃度處理間差異均顯著。結果表明，3種苔蘚植物在鈾脅迫下其抗氧化系統應答表現為低促高抑，且大灰蘚小型變種對鈾脅迫具有較強的耐受性。

3 討論

鈾脅迫對3種苔蘚植物的毒害作用主要表現在高濃度時使其莖葉變黃變黑，并阻礙莖葉生長發育，其莖葉與空白對照相比變小，出現不同程度的萎縮現象。假根在鈾脅迫下無明顯變化，可能是因為苔蘚植物主要依靠葉片吸收養分，對環境變化較為敏感，而假根主要起固定植物體的作用，極少進行物質交換。苔蘚植物對鈾有一定的累積能力，且3種苔蘚植物體內鈾累積量與外源鈾濃度呈正相關。富集系數（BCF）是指植株體內元素含量與環境元素含量之比，其值越大，則表明植物吸收能力越強。趙繼武等［9］研究了黑麥草的鈾富集特性，其BCF最高可達6.28，劉澤偉等［16］研究了蠶豆幼苗的鈾累積特性，在鈾濃度為25 μmol/L處理下其地下部鈾累積量可達5 309 mg/kg（DW）。韓旭等［17］研究水芹和銅錢草對鈾的富集濃度在55 mg/L處理下根、莖和葉各部鈾濃度分別達到3637.2、322.9、373.4 mg/kg和2 908.8、262.7、136.5 mg/kg。本試驗中，不同種類苔蘚的鈾累積能力有顯著差異，其中累積能力最強的大灰蘚小型變種，在鈾濃度為20 μmol/L時為3 440.67 mg/kg（DW），BCF僅0.43。可見，苔蘚植物對鈾的累積能力不及某些超富集植物，原因可能為苔蘚植物生物量較小，且極少通過假根進行物質交換。然而，在實際鈾礦山生態修復中，大多數鈾富集能力強的高等植物無法被種植在土壤殘存量較少的貧瘠荒、石漠化土地上，只能依靠苔蘚作為先鋒植物，首先覆蓋在工程創面或鈾礦裸巖之上，使巖石風化成土，進一步導致巖石分解、土層增厚、有機質增加，為高等植物提取鈾創造先決條件。本試驗中，大灰蘚小型變種對鈾有一定的累積能力和耐受性，有聯合超富集植物修復鈾礦山貧瘠石漠化土地的潛力。

重金屬離子能與植物體內其他化合物結合成金屬絡合物或螯合物，抑制蛋白質的合成［18］。3種苔蘚可溶蛋白含量顯著性變化表明，鈾脅迫擾亂了苔蘚植物體內蛋白質的合成。低濃度鈾溶液引起可溶性蛋白含量增加可能是植物抗鈾的解毒機制，其可以提高細胞的滲透濃度和功能蛋白的數量，有助于維持細胞正常代謝。然而，高濃度的鈾對蛋白質合成有破壞性影響。首先，鈾進入細胞后，提高了蛋白水解酶的活性，促進了原有蛋白質的分解。其次，鈾對許多蛋白質合成酶系統具有毒性和純化作用，破壞蛋白質合成的相關細胞器，抑制新蛋白質的合成。脯氨酸作為非酶抗氧化劑中的重要水溶性化合物，在植物體中不僅能起滲透調節作用，還能清除活性氧［19-20］，通過抗氧化系統的協同作用精密地調控植物細胞中活性氧的平衡［21］。此外，Kaul等［14］認為，重金屬脅迫能引起植物體內脯氨酸的快速累積，還可誘導GSH水平的上升，從而進一步增強抗氧化能力。本試驗中，大灰蘚小型變種與砂蘚脯氨酸含量隨著鈾脅迫濃度的上升表現為“低促高抑”。當外源添加鈾脅迫時，苔蘚植物自身啟動抗逆生理反應以抵抗重金屬毒性的傷害，因此脯氨酸含量上升；當鈾脅迫濃度不斷升高，苔蘚植物脯氨酸含量有所下降，表明其細胞結構遭到嚴重破壞，已無法累積脯氨酸。而大灰蘚脯氨酸含量與鈾脅迫濃度呈正相關，其原因可能是大灰蘚對鈾脅迫的耐受性強于大灰蘚小型變種和砂蘚，且累積脯氨酸能力較強，在鈾濃度為20 μmol/L時其細胞結構并沒有被嚴重破壞，仍能正常累積脯氨酸以抵抗重金屬脅迫。MDA含量的測定往往能反映機體脂質過氧化水平，間接反映細胞損傷程度［22］。本試驗中，3類苔蘚植物體內MDA含量均與鈾濃度呈正相關，表明膜脂過氧化程度加劇，細胞膜透性也逐漸增加，細胞膜透性越大表明細胞內含物流失越嚴重，細胞損傷程度越大。林喆［23］研究了齒肋赤蘚在不同濃度Hg脅迫下MDA含量的變化，結果表明Hg濃度與齒肋赤蘚的脯氨酸含量呈正相關。孫天國等［24］研究了（Zn2+、Cu2+、Pb2+和Cd2+）溶液對東亞砂蘚和擬垂枝蘚MDA含量的影響，結果表明MDA含量具有應激效應。本研究結果與前人相似。鈾脅迫類似于其他形式的氧化脅迫，能導致植物體產生大量自由基，這些自由基對植物細胞膜有損害作用［25］。植物體能自身形成一種保護系統來清除自由基以減輕危害［26］。這套保護系統由抗氧化保護酶類和非酶抗氧化保護劑組成。SOD、POD、CAT是3種尤為重要的抗氧化保護酶。其中SOD能維持機體的氧化與抗氧化平衡，能清除超氧陰離子自由基（O2-·）保護細胞免受損傷；POD能清除植物細胞中的活性氧，是植物體內清除H2O2的關鍵酶［27］；CAT能夠促進H2O2迅速分解為分子氧和水，廣泛存在于植物細胞中［28］。三者聯合作用以清除植物體內產生過量的自由基和過氧化物［29］。一般而言，植物對鈾脅迫產生響應通常表現為低濃度刺激正向應答，高濃度產生抑制作用［30］。本試驗中3類苔蘚植物抗氧化保護酶活性的變化證實這點，大灰蘚、大灰蘚小型變種、砂蘚的SOD、POD、CAT活性均隨著鈾處理濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢，說明低濃度鈾脅迫時，苔蘚植物開啟抗氧化保護系統，清理多余的自由基和過氧化物，保護細胞免受損傷，而高濃度的鈾破壞了苔蘚植物抗氧化系統的動態平衡，植物受到過氧化毒害加劇，抗氧化系統機能減緩。本試驗中大灰蘚抗氧化保護酶活性在鈾濃度為5 μmol/L時達到峰值，隨后隨著鈾濃度增加活性降低。大灰蘚小型變種與砂蘚的抗氧化保護酶活性在鈾濃度為15 μmol/L時達到峰值，然后隨鈾濃度增加活性降低，表明大灰蘚小型變種和砂蘚對鈾脅迫的耐受性優于大灰蘚。

本研究結果表明，鈾對苔蘚植物莖葉產生了顯著的毒性現象。中低濃度（5～10 μmol/L）鈾脅迫對3類苔蘚植物可溶性蛋白、脯氨酸含量的累積有一定的促進作用，高濃度（15～20 μmol/L）鈾脅迫對其有顯著破壞作用。3類苔蘚MDA含量隨著鈾濃度的增加顯著上升，3類苔蘚抗氧化酶活性均表現為低濃度（5～10 μmol/L）刺激正向應答，高濃度（15～20 μmol/L）產生抑制作用。3種苔蘚對鈾有一定的累積能力，鈾累積能力表現為大灰蘚小型變種＞大灰蘚＞砂蘚。可見，苔蘚植物在一定范圍鈾濃度脅迫下能通過激活抗氧化保護機制作出應答，以抵抗鈾毒性的傷害，對鈾有一定的耐受性，同時大灰蘚小型變種對鈾的富集能力較好，雖然不及一些超富集植物，但是將苔蘚植物作為鈾礦山荒石漠化地區生物修復的先鋒植物，聯合超富集植物進行原位修復是可行的，具有較好的應用前景。

4 結論

鈾脅迫對苔蘚植物生長發育有一定的毒害作用，表現為莖葉發黃發黑、植物體萎縮。3種苔蘚對鈾的累積能力不及某些超富集植物，因此不能替代超富集植物從土壤中提取鈾，但在鈾礦山荒石漠化地區中能作為先鋒植物，加速裸巖風化、增厚土層，搭配超富集植物聯合修復含鈾礦土。中低鈾濃度下苔蘚植物通過調節抗氧化保護系統以抵抗鈾脅迫，這種應答在高濃度鈾脅迫下隨著鈾毒性加強，細胞結構被破壞而受到抑制。其中，大灰蘚對鈾脅迫的敏感性高于大灰蘚小型變種與砂蘚，可作為鈾污染指示植物。大灰蘚小型變種表現出一定的耐鈾能力和富集能力，有用于鈾礦山苔蘚結皮-超富集植物聯合修復的潛力。