塞內卡病毒A間接ELISA檢測方法的建立及應用

王彩霞，張 舟，范燕茹，馮春燕，吳紹強，林祥梅

(1.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 大興 100176；2.河南城建學院生命科學與工程學院，河南 平頂山 467036)

2002年，研究人員發現了一種名為塞內卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)的新病毒，將其歸類為一個新的病毒屬，其唯一的代表株是塞內卡病毒A(Senecavirus A，SVA)[1]。SVA感染后可引起豬鼻鏡及蹄冠等處出現水皰、潰爛創面，偶見發燒及腹瀉，可導致新生仔豬發生急性死亡，給養豬業帶來巨大經濟損失[2]。截止到目前為止，美國、加拿大、中國、巴西、哥倫比亞、泰國等多個國家已經報道了多起SVA感染豬的病例[3-7]，這引起了國內外眾多研究者的重視。目前，國內外已經建立了多種針對SVA的檢測方法，例如RT-PCR檢測方法[8]、熒光定量PCR方法[9]、原位雜交檢測方法[10]、反轉錄重組聚合酶常溫擴增技術(RT-RPA)快速檢測方法[11]、ELISA檢測方法[12]等。其中ELISA方法因其原理簡單，操作簡便，靈敏，快速，適用性廣泛，成為血清學診斷技術中的常用技術手段，但篩選一個理想的檢測抗原是ELISA方法研究中的重中之重。本研究將VP2和VP3全長基因克隆到表達載體上，誘導表達為一個組合重組蛋白，暫記為VP2/3，通過優化反應條件建立了針對VP2/3蛋白的間接ELISA方法，并進一步利用該ELISA方法檢測人工感染SVA后不同時間采集的豬血清樣品，繪制了豬體感染SVA后VP2/3蛋白抗體的消長規律，以便為后續相關疫苗免疫程序的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SVA分離株GD01/2017(GenBank登錄號：MH316114)由揚州大學獸醫學院江蘇省動物預防醫學重點實驗室惠贈。豬口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病等陽性血清本實驗室保存。載體pET30a(+)、感受態DH5α和BL21 (DE3)，由中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所實驗室保存。

1.2 主要試劑 DL-2 000 DNA Marker、pMD 18-T載體、低分子蛋白Marker、T4 DNA 連接酶、限制性內切酶、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-NTA瓊脂糖樹脂和病毒RNA提取試劑盒，均購自Qiagen公司；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物及血清 20日齡SPF豬，購自北京市SPF豬育種管理中心，攻毒劑量為109TCID50/頭豬，攻毒前采樣記為第0天，攻毒后的第1～14天每天采樣，樣品標記為D1、D2……D14，攻毒后第6天進行二次攻毒，在二次攻毒后的第11、14、18天采樣，樣品標記為D16、D19、D23。同時設立SPF豬血清對照組，并在同樣時間采集血清樣品。SVA陽性對照血清和SPF豬陰性對照血清，由中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所實驗室保存。

1.4 序列分析、合成及引物設計 根據SVAGD01/2017分離株(GenBank登錄號：MH316114)VP2、VP3基因序列設計1對引物，并在基因兩端加入EcoRⅠ、XhoI酶切位點。引物序列為：VP23F：5′-CGCGAATTCGATCACAATACCGAAGA-3′(下劃線處為EcoR I識別位點)；VP23L：5′-ATACTCGAGGTGGAACACGTAGGAAGG-3′(下劃線處為XhoI識別位點)，預期擴增片段大小為1 569 bp。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.5 原核表達載體的構建 利用病毒RNA提取試劑盒提取SVA GD01-2017分離株RNA，以該RNA為模板，用引物VP23F和VP23L通過RT-PCR擴增目的基因序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，膠回收目的片段。將回收的目的片段和pET-30a (+) 載體分別進行EcoRⅠ和XhoI雙酶切，電泳回收VP2/3和載體片段，將二者用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉化BL21 (DE3) 感受態，篩選表達菌。經測序鑒定正確的陽性重組質粒命名為pET-30Ba-VP2/3。

1.6 VP2/3的原核表達 分別取陽性菌液100 μL，接種2管卡那霉素抗性的液體LB中，每管10 mL培養基，培養至OD600值在0.4～0.6時，分別取菌液1 mL為誘導前對照，然后加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，1管菌液20 ℃誘導過夜，1管37 ℃誘導過夜，同時設pET-30a (+) 誘導菌為空白對照。

1.7 重組蛋白的SDS-PAGE分析 取誘導后的pET-30a-VP2/3菌液離心后棄上清，用 PBS 重懸后超聲裂解分離上清和沉淀，分別取不同誘導條件下表達的適量上清和沉淀制備SDS-PAGE樣品，同時以pET-30a (+) 作為對照,進行SDS-PAGE電泳。

1.8 VP2/3蛋白的大量表達及純化 將pET-30a-VP2/3菌液接種200 mL培養液中，37 ℃大量誘導表達目的蛋白。離心收集菌體沉淀后，超聲裂解，離心洗滌包涵體，去除雜蛋白，收集VP2/3包涵體蛋白，參照文獻[13]中的方法對包涵體蛋白進行處理，并以Ni+柱親和層析純化VP2/3蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，并取2 μL純化蛋白制樣進行SDS-PAGE檢測，其余蛋白分裝后-80 ℃保存備用。

1.9 以VP2/3蛋白作為包被抗原建立間接ELISA方法

1.9.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 將VP2/3蛋白用包被液稀釋成0.000 1 μg/μL，0.000 5 μg/μL，0.001 μg/μL，0.002 μg/μL，0.004 μg/μL，0.006 μg/μL，0.008 μg/μL，0.01 μg/μL，然后每孔100 μL包被酶標板，4 ℃包被過夜。SPF豬血清和SVA陽性血清按1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160倍稀釋。采用棋盤滴定法計算每個反應條件下的P/N值，P/N值最大的反應組合作為間接ELISA的最佳反應條件。

1.9.2 間接ELISA工作條件的優化 在37 ℃條件下分別采用1%BSA，2%BSA，5%BSA，4%羊血清，2%馬血清封閉1 h確定最佳封閉液；酶標二抗分別按1∶500，1∶1 000，1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500，1∶3 000，1∶4 000稀釋，確定最佳二抗稀釋濃度。TMB室溫顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止顯色。

1.9.3 間接ELISA方法的特異性檢測 采用所建立的ELISA方法對豬口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病等陽性血清進行檢測，同時設SVA陽性血清和SPF豬血清作為對照，以檢測該方法的特異性。

1.10 人工感染SVA后豬體VP2/3抗體的消長規律研究 采用本研究所建立的ELISA方法檢測人工感染SVA后不同時間采集的豬血清樣品，根據檢測結果繪制抗體消長規律圖。

2 結果

2.1 重組表達質粒的構建及表達 以提取的SVA全RNA為模板擴增出VP2/3目的基因，經EcoR I和XhoI雙酶切后與pET30a(+)片段連接構建重組表達質粒。經測序正確的陽性質粒用于后續原核表達。對不同誘導條件下的菌體上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測(圖1)，結果表明，蛋白無論是低溫誘導還是高溫誘導均以包涵體形式表達，高溫誘導時蛋白的表達量較高，蛋白大小為66 kD，與預期大小一致。

2.2 包涵體蛋白VP2/3的純化 大量誘導表達后收集菌體沉淀，按照文獻中的方法對包涵體蛋白進行洗滌并純化，測定蛋白濃度為5.3 mg/mL，取2 μL純化蛋白制樣進行SDS-PAGE檢測，結果見圖2，純化后的VP2/3蛋白比較純，可以用于后續試驗。

圖2 純化的包涵體蛋白的SDS-PAGE檢測結果Fig.2 The detected result of purified inclusion body by SDS-PAGE

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度的確定 通過棋盤滴定法確定了最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋倍數，檢測數據見中插彩版圖3，當VP2/3抗原包被濃度為0.2 μg/孔，一抗血清稀釋度為1∶80時，P/N值最大，因此將其確定為該ELISA檢測方法的最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數。

2.3.2 最佳封閉液的確定 封閉液的優化結果見圖4，從圖中我們可以看出，在其他條件相同的情況下，當以1%BSA封閉時，P/N值最大，因此，選擇1%BSA作為該ELISA方法的最佳封閉液。

圖4 最佳封閉液的確定Fig.4 Determination of the sealing buffer

2.3.3 最佳酶標抗體稀釋度的確定 HRP標記的兔抗豬抗體分別按照1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶4 000的稀釋度稀釋后進行ELISA檢測，檢測結果見圖5，可見當酶標抗體為1∶2 000時P/N值最大，由此確定該ELISA方法的最佳酶標二抗稀釋度為1∶2 000。

圖5 最佳兔抗豬HRP酶標二抗稀釋度的確定Fig.5 Determination of the anti-antibody

2.3.4 ELISA方法的特異性檢測 以本研究所建立的ELISA方法對豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)等陽性血清進行檢測，同時設置陰陽性對照，檢測結果見表1，其他相關病毒檢測結果均為陰性，這表明該方法具有良好的特異性，與其他豬相關病毒無交叉反應。

表1 ELISA方法的特異性檢測結果Table 1 The specificity result of ELISA method

2.4 感染SVA后豬體VP2/3蛋白抗體的消長規律研究 利用本研究所建立的ELISA方法檢測人工感染SVA后不同時間采集的豬血清樣本，根據ELISA檢測結果繪制VP2/3蛋白抗體消長規律曲線圖(圖6)。從圖中可以看出，在病毒感染后，第6天左右抗體滴度顯著升高，第8～9天達到最高，并且在6～9 d時抗體滴度呈現線性上升，第9天以后抗體滴度逐步下降，直至第1次攻毒后的第23天，抗體降至SPF豬正常水平。

圖6 人工感染SVA后豬體的VP2/3抗體消長規律圖Fig.6 Law of growth and decline on VP2/3 antibody caused by artificial infection

3 討論

SVA基因組為單股正鏈RNA，只有1個ORF，在病毒編碼蛋白酶的作用下，可裂解成先導蛋白(L)和P1，P2，P3三個蛋白中間體，P1可進一步裂解成VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白，P2可裂解成2A、2B、2C三種非結構蛋白，P3可裂解成3A、3B、3C、3D四種非結構蛋白[14-16]。其中VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白組成SVA的衣殼蛋白，具有較強的抗原性，可以刺激動物機體產生特異性免疫反應，是塞內卡病毒主要的診斷靶抗原[12,17-18]。目前，A型塞內卡病毒的蛋白成熟機制并不十分清楚，P1前體是否與其他小RNA病毒一樣剪切成VP1、VP2、VP3、VP4或者以其他形式發揮功能，仍然有待于進一步的研究證實。Dvorak C M等的研究結果表明，SVA早期感染即出現臨床癥狀后0～4 d，ELISA方法比IFA方法更敏感[12]，而且VP2蛋白比VP1蛋白更加保守，更適合用于血清學檢測[19-20]，本研究室前期已經進行了結構蛋白VP2的克隆表達并驗證了其抗原性[18]。本研究將VP2和VP3全長基因進行了擴增，重組表達了塞內卡病毒A組合蛋白VP2/3，建立了針對VP2/3的間接ELISA檢測方法，為今后SVA檢測抗原的篩選提供了理論依據，并且為SVA 的快速診斷以及流行病學調查提供了技術手段。通過試驗最終確定，本研究所建立的SVA VP2/3 間接ELISA檢測方法的最佳檢測條件為：以VP2/3蛋白0.2 μg/孔，4 ℃包被過夜，PBST洗3次，每次5 min；1%BSA 37 ℃封閉1 h，PBST洗3次，每次5 min；一抗陽性血清稀釋度1∶80，37 ℃孵育1 h，PBST洗5次，每次5 min；兔抗豬HRP標記二抗稀釋度為1∶2 000，37 ℃孵育1 h，PBST洗5次，每次5 min；TMB顯色15 min，終止后OD450nm值讀數，分析數據。

有研究表明，VP2和VP3可能具有SVA早期感染中和抗體的識別位點[21]，研究其抗體消長規律對疫苗免疫程序的制定具有重要的指導意義。因此本研究應用所建立的VP2/3 ELISA檢測方法，進一步研究了SVA攻毒后不同時間采集的豬血清樣品中VP2/3抗體的消長規律。從研究結果可以看出，在病毒感染后，第4天感染豬出現臨床癥狀，第6天左右抗體滴度顯著升高，第8～9天達到最高，表明病毒感染后8～9 d抗體滴度最高。同時從結果也可以看出，6～9 d抗體滴度呈現線性上升，從側面進一步驗證了VP2/3間接ELISA方法可用于SVA抗體的檢測。第9天以后，抗體滴度逐步下降，持續監測顯示，第14天左右抗體出現小波動，滴度再次出現輕微上升，推測與第6天二次攻毒相關。第1次攻毒的第23天后，抗體降至SPF豬正常水平。

綜上，本研究建立了基于結構蛋白VP2/3的SVA間接ELISA的檢測方法，為SVA檢測抗原的篩選提供了依據；并進一步利用該方法檢測了攻毒樣品，結果顯示攻毒后的第8～9天，VP2/3的抗體滴度達到最高，為后續疫苗免疫程序的制定提供了一定的理論依據。