奶牛乳房炎源葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗

李 托，李隴平,2，賀綏樂，楊 學

(1.榆林學院生命科學學院，陜西 榆林 719000 ;2.榆林學院 陜西省陜北絨山羊工程技術研究中心，陜西 榆林 719000)

奶牛乳房炎是由多種微生物感染及各種物理、化學因素刺激和機械性損傷而導致的奶牛乳腺組織及乳頭發炎的一種疾病[1]。病原微生物定植、感染奶牛乳腺組織是誘發奶牛乳房炎的重要原因，其中最主要的致病菌有葡萄球菌和鏈球菌[2]。奶牛乳房炎不僅增加奶牛死亡率和淘汰率[1]，嚴重危害奶牛健康，影響牛奶品質，給養牛業造成巨大經濟損失[3]，而且還威脅著人類健康[4-5]。金黃色葡萄球菌是引發奶牛乳房炎的主要病原菌，感染率很高[2]。隨著抗生素的大量使用，甚至濫用，導致耐藥菌株特別是多重耐藥菌株不斷出現，并快速傳播，抗生素耐藥問題已經成為影響人類健康和養殖業健康發展的重要因素[6-7]。除了金黃色葡萄球菌(凝固酶陽性菌)能夠引起奶牛乳房炎外，近年來越來越多的研究表明，凝固酶陰性葡萄球菌不僅會對抗生素產生高水平耐藥率，而且也會造成嚴重的感染后果，從而受到廣泛重視[8-10]。因此，及時、準確、快速的對導致奶牛乳房炎的主要病原菌及其抗生素耐藥性進行診斷和研究，對于病區奶牛乳房炎的治療意義重大。本試驗通過對陜北地區某奶牛場采集的患病奶牛新鮮乳汁進行葡萄球菌的分離鑒定以及藥敏試驗，為該奶牛場臨床合理使用抗菌藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Baird-Parker、亞碲酸鉀卵黃鹽水、高鹽甘露醇瓊脂，均購自青島海博生物技術有限公司；Mueller Hinton瓊脂和藥敏紙片，均購自英國OXOID公司；2×EasyTaq?PCR SuperMix(+dye)和pEasy?-T5 Zero Cloning Kit，均購自北京全式金生物技術有限公司；引物由上海百力格生物科技有限公司合成。

1.2 樣品采集 從陜北某奶牛養殖場采集患乳房炎的新鮮牛奶樣品98份。采集樣品時，首先對奶牛乳頭消毒，棄去頭3把奶，收集新鮮奶樣約10 mL，24 h內進行細菌培養。

1.3 細菌分離培養 無菌條件下用接種環蘸取少量奶樣，接種Baird-Parker瓊脂平板和高鹽甘露醇瓊脂平板，37 ℃倒置培養16～48 h。挑取疑似菌落革蘭染色、鏡檢。

1.4 分子生物學鑒定

1.4.1 細菌基因組提取(煮沸法) 挑取單菌落于2 mL液體LB培養基中，37 ℃、220 r/min過夜培養，取1 mL培養菌懸液12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL無菌水重懸沉淀；水洗1次；100 ℃煮沸10 min；室溫放置10 min；冷卻至室溫后12 000 r/min離心10 min；收集上清液，即得到DNA。

1.4.2 分離株16S rDNA基因擴增 以煮沸法提取的DNA為模版，引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′)進行PCR分子鑒定。50 μL體系：2×EasyPCR SuperMix(+dye) 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，68 ℃→58 ℃(每個循環降低1 ℃)退火30 s，72 ℃延伸90 s，11個循環；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個循環；72 ℃終延伸10 min。

PCR擴增產物回收純化后連接pEasy?-T5 Zero Cloning，轉化Trans1-T1，挑選經PCR(M13F和M13R)鑒定陽性的克隆接種2 mL LB/Amp+培養基，200 r/min、37 ℃培養6 h，送至上海百力格生物科技有限公司進行測序，基因序列BLAST同源性比對。

1.5 藥敏試驗 分離菌株接種2 mL LB液體培養基，37 ℃、220 r/min過夜培養；分別取100 μL與900 μL生理鹽水混勻，調整菌液濃度至1.5×108CFU/mL(0.5麥氏標準)；無菌棉簽蘸取菌懸液均勻涂抹M-H平板；待自然干燥后，將藥敏紙片貼至培養基表面；37 ℃、倒置培養18～24 h后，測量抑菌圈直徑。依照美國臨床實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的推薦標準判定藥物敏感性[11-12](表1)。

表1 藥物敏感性判定標準Table 1 The criteria for judging the drug sensitivity

2 結果

2.1 細菌分離鑒定

2.1.1 分離菌株的生長形態特征 從89份乳樣中分離得到56株葡萄球菌，包括33株金黃色葡萄球菌，6株表皮葡萄球菌，5株溶血葡萄球菌；5株產色葡萄球菌，4株松鼠葡萄球菌，3株腐生葡萄球菌。33株金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上菌落呈黑色、周圍有暈圈，高鹽甘露醇平板上生長的菌落呈黃色。除了33株金黃色葡萄球菌以外的其他23株葡萄球菌，在Baird-Parker瓊脂平板上呈現黑色菌落。革蘭染色結果顯示，分離株為革蘭染色陽性，葡萄串狀(圖1)。

圖1 分離菌株革蘭染色的鏡檢結果(100×)Fig.1 Microscopic colony morphology results of gram staining of isolated strains(100×)

2.1.2 分子生物學鑒定 煮沸法提取分離株基因組DNA后，用通用引物擴增16S rDNA基因，擴增產物大約1 500 bp，與目的片段大小一致。回收擴增產物連接pEasy?-T5 Zero Cloning載體，轉化Trans1-T1感受態細胞，鑒定陽性的克隆測序并BLAST比對，33株為金黃色葡萄球菌(58.9%，33/56)，6株為表皮葡萄球菌(10.7%，6/56)，5株為溶血葡萄球菌(8.9%，5/56)，5株為產色葡萄球菌(8.9%，5/56)，4株松鼠葡萄球菌(占7.1%，4/56)，3株為腐生葡萄球菌(5.4%，3/56)。

2.2 藥敏試驗 56株分離菌均表現出不同程度的耐藥性，且40%為多重耐藥菌。33株金黃色葡萄球菌中耐單一藥物的有4株(12%)，對復方新諾明、氨芐西林和克林霉素的耐藥率最高，分別為97%、75.8%和60.6%，其次為紅霉素(48.5%)，耐藥率低于10%的為四環素(9%)、替考拉寧(全部敏感)、氯霉素(全部敏感)、頭孢西丁(全部敏感)、苯唑西林(全部敏感)和頭孢噻吩(全部敏感)(表2)。

表2 33株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗Table 2 Drug sensitivity test results of 33 Staphylococcus aureus isolates

除金黃色葡萄球菌以外的23株其他葡萄球菌，均對替考拉寧、氯霉素和頭孢菌素敏感，耐藥種類數最多的1株表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌能夠耐受7種藥物(同時對苯唑西林和產生耐藥)。見表3。

表3 23株其他葡萄球菌的藥敏試驗結果Table 3 Drug sensitivity test results of 23 staphylococci isolates

3 討論

金黃色葡萄球菌是導致奶牛乳房炎的主要致病菌，能夠長期定植奶牛乳腺組織，導致奶牛乳房發生病變和產奶量下降，嚴重時可致奶牛死亡，金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎占50%左右[13-14]。本試驗中金黃色葡萄球菌的感染率(37.1%，33/89)偏低，提示除了金黃色葡萄球菌以外，其他類型的葡萄球菌或/和其他類型的細菌在該奶牛場的乳房炎發病過程中可能發揮了作用。引起奶牛乳房炎的葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌的分離率較高、致病力強、危害嚴重，是一種引起奶牛乳房炎的主要病原菌。除了金黃色葡萄球菌以外的其他葡萄球菌由于致病力不強，引起的乳腺炎疾病癥狀也比較溫和，常被認為是次要病原菌。但是，近幾年的研究表明，除了金黃色葡萄球菌以外的其他葡萄球菌分離率也有不斷增高的趨勢，且也能夠產生較高水平耐藥[10,15-16]，引起國內外學者重視[10]。本試驗分離的除33株金黃色葡萄球菌以外的23其他葡萄球菌中，47.8%(11/23)為多重耐藥菌株，其中1株表皮葡萄球菌和1株溶血葡萄球菌對苯唑西林和頭孢西丁也產生耐藥。這些結果提示，除金黃色葡萄球菌以外，其他葡萄球菌在導致本試驗牛場的奶牛乳房炎中起到了一定的作用，從而使該牛場奶牛乳房炎的有效防治變得更加復雜，治療效果可能會產生一定的延緩。本試驗結果為該牛場的奶牛乳房炎的防治策略提供了科學依據。

藥敏試驗結果表明，33株金黃色葡萄球菌對復方新諾明(97%)、氨芐西林(75.8%)和克林霉素(60.6%)的耐藥率最高，其次為紅霉素(48.5%)和四環素(9%)。本試驗結果發現，試驗牛場中金黃色葡萄球菌對青霉素、氨芐西林、紅霉素和四環素的耐藥率不高，低于哈愛日等[17]和張莉莉[18]的研究結果，但是對磺胺類(SXT25)和林可胺類(DA2)有較高水平耐藥率，說明試驗牛場可能經常選用這些藥物來治療奶牛疾病，表明金黃色葡萄球菌耐藥性可能具有區域性特點。為了避免濫用抗生素，選擇試驗中敏感性高的藥物，規范抗生素的使用，并積極探索替抗手段(噬菌體、中草藥和抗菌肽等)，是經濟、有效、科學防治奶牛乳房炎的一種可行性選擇。除此之外，有效控制奶牛乳房炎，還應做到保證飲水和墊料清潔、保持牛舍內外環境衛生，勤打掃，勤換墊料，規范擠奶操作，避免交叉感染；另一方面，建立乳房炎早期診斷，做好隱性乳房炎的防治和控制傳染源。