致羔羊腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

李 托，李隴平,2，張起艷，高 妮，薛佳敏

(1.榆林學院生命科學學院，陜西 榆林 719000 ;2.榆林學院 陜西省陜北絨山羊工程技術研究中心，陜西 榆林 719000)

以陜北白絨山羊為主的羊產業已經成為陜北地區農業發展和農牧民增收的主導產業，對區域經濟發展具有不可替代的重要作用[1]。但是，羔羊和成年羊只的大面積群體性死亡一直是困擾陜北白絨山羊養殖的一個重要問題。其中，致病性大腸桿菌可以誘導山羊多種致死性疾病，病理復雜多樣，導致包括以敗血癥和劇烈腹瀉為特征的急性傳染病和乳房炎，不僅危害泌乳期母羊自身健康，而且嚴重危害羔羊健康[2-3]。有效防治山羊大腸桿菌病是促進山羊產業健康、快速、可持續發展的關鍵。目前，抗生素仍然是有效防治山羊疾病的主要手段，從而造成多種抗生素的大量使用，甚至是濫用。大量使用抗生素導致耐藥基因和耐藥細菌特別是多重耐藥菌株不斷出現和快速傳播[4-6]，不僅破壞動物體內正常微生態平衡，危害動物健康和生態環境[7]，而且造成藥物在動物體內殘留進入人們餐桌，威脅人類健康和公共食品衛生安全[8]。抗生素耐藥問題已經成為影響人類健康和養殖業健康發展的重要因素[9]。

本試驗通過采集患病羔羊組織樣品，利用常規生物化學方法和分子生物學方法對導致羔羊腹瀉的大腸桿菌進行分離鑒定，并對分離菌株的血清型、耐藥性和致病性進行檢測，為有效防控陜北地區絨山羊源大腸桿菌病提供科學依據。

1 材料

1.1 病料 從陜西省榆林市某規模化絨山羊養殖場采集1只病死羔羊的肝臟、腎臟、脾臟、肺臟和直腸棉拭子。

1.2 主要試劑 細菌微量生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；Mueller Hinton瓊脂、藥敏紙片，均購自英國OXOID公司；引物由上海百力格生物科技有限公司合成；大腸桿菌診斷血清，購自中國獸醫藥品監察所；20 g左右健康昆明系小鼠20只，購自西安交通大學醫學院。

2 方法

2.1 細菌分離純化 樣品分別接種于LB和麥康凱瓊脂，37 ℃倒置培養16～24 h；選擇優勢菌落接種伊紅美藍瓊脂，觀察菌落形態為紫黑色并帶有金屬光澤；挑取伊紅美藍瓊脂上的典型菌落培養過夜，與等體積50%的甘油混勻,-80 ℃保存備用。

2.2 細菌革蘭染色 草酸銨結晶紫初染1～2 min；碘液媒染1～3 min；95%酒精脫色30 s；沙黃溶液復染1 min；最后，油鏡觀察菌落染色及形態。

2.3 細菌的生化試驗 純培養的菌液接種至不同細菌微量生化鑒定管(甲基紅、V-P、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、吲哚、山梨醇、枸椽酸鹽、尿素酶、硫化氫等)進行細菌初步鑒定。

2.4 細菌的血清型鑒定 采用玻片法鑒定分離菌株的O血清型類別。

2.5 細菌的分子生物學鑒定

2.5.1 細菌基因組提取(煮沸法) 37 ℃、220 r/min過夜培養菌液取1 mL，12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL無菌水，清洗1次；100 ℃煮沸10 min；室溫放置10 min；冷卻至室溫后12 000 r/min離心10 min；收集上清液，即得到DNA；取5 μL DNA進行電泳檢測，其余-20 ℃保存備用。

2.5.2 細菌16S rDNA基因擴增 以煮沸法提取的DNA為模版擴增分離株的16S rDNA基因，使用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增，片段大小預計1 492 bp，50 μL擴增體系：2×Easy PCR SuperMix(+dye)25 μL，上下游引物各1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，68 ℃→58 ℃(每個循環降低1 ℃)進行11個循環，72 ℃ 90 s，25個循環;72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產物回收純化后連接pEasy?-T5 Zero Cloning載體，轉化Trans1-T1感受態細胞，經PCR(M13F和M13R)鑒定陽性的克隆接種2 mL LB/Amp+培養基，200 r/min、37 ℃培養6 h后，送上海百力格生物科技有限公司測序。序列BLAST同源性比對，并構建系統進化樹。

2.5.3 藥敏試驗 選擇紅霉素、克林霉素、頭孢噻吩、恩諾沙星、鏈霉素、亞胺培南、氨芐西林、四環素、慶大霉素、復方新諾明、氟苯尼考、硫酸黏菌素、頭孢他定、氯霉素共14種抗菌藥物進行藥敏試驗。100 μL菌液和900 μL生理鹽水混勻，調整菌液濃度1.5×108CFU/mL(相當于0.5麥氏標準)。無菌棉簽蘸取菌懸液均勻涂抹M-H瓊脂。自然干燥后用滅菌鑷子夾取藥敏紙片貼于培養基表面，邊緣距邊緣15 cm，37 ℃倒置培養18～24 h，測量抑菌圈直徑。敏感性判定標準參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》[10-11]。

2.6 致病性試驗 20只小鼠分為4組，每組5只。3個試驗組進行攻毒，每組按0.5 mL/只的菌液(1×108CFU/mL)腹腔注射，對照組小鼠注射0.5 mL/只LB培養基。觀察小鼠發病及死亡情況，剖檢，采集小鼠肝臟、肺臟等組織進行細菌分離。

3 結果

3.1 細菌分離鑒定

3.1.1 細菌分離及形態學鑒定 采集1只病死羔羊的肝臟、腎臟、脾臟、肺臟和直腸棉拭子樣品，嚴格無菌條件下接種LB瓊脂和伊紅美藍瓊脂培養后，共分離到3株大腸桿菌，命名為EG-1，EG-2，EG-3。分離株在LB瓊脂上的菌落形態為圓形、凸起、光滑、灰白色、半透明，直徑為2～3 mm；麥康凱瓊脂平板上菌落形態為邊緣光滑整齊、濕潤的扁圓粉紅色；伊紅美藍瓊脂平板上的菌落形態為圓形、表面光滑、稍凸起、邊緣整齊、紫黑色并帶金屬光澤。分離株革蘭染色為紅色(革蘭陰性菌)、兩端鈍圓、桿狀。

3.1.2 細菌生化鑒定 分離株均能發酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖和甘露糖，尿素酶、阿拉伯糖、鼠李糖、麥芽糖、山梨醇、賴氨酸脫羧酶，產酸不產氣；吲哚試驗、甲基紅試驗結果均為陽性，V-P 試驗、硫化氫試驗及枸櫞酸鹽試驗結果均為陰性，根據《伯杰細菌鑒定手冊》的判斷標準，分離株與大腸桿菌生化特性相一致。

3.1.3 細菌血清型鑒定 血清學試驗表明，分離的3株大腸桿菌屬于2個不同的血清型，EG-1為O119型，EG-2和EG-3為O24型。

3.2 分子生物學鑒定 煮沸法提取基因組DNA后通用引物擴增分離株16S rDNA基因，PCR擴增條帶與目的片段大小一致(圖1)。測序結果表明：分離株與NCBI數據庫中大腸桿菌菌株同源性在99.7%以上，與大腸桿菌44A(登錄號：KP789331.1)、NCTC122(登錄號：LT906474.1)和ECOL-18-VL-LA-PA-Ryan-0026(登錄號：CP041392.1)在同一個遺傳進化分支上，與糞腸球菌NCTC8732(登錄號：LR594051.1)親緣關系較遠(圖2)。

3.3 藥敏試驗 分離株均對紅霉素、克林霉素、恩諾沙星、鏈霉素、氨芐西林、四環素、慶大霉素、黏菌素產生耐藥；所有菌株對亞胺培南、頭孢他定和氯霉素敏感；除此之外，EG-1對頭孢噻吩、復方新諾明和氟苯尼考均產生耐藥，EG-2對復方新諾明和氟苯尼考產生耐藥，EG-3對這3種抗生素菌均敏感(表1)。

表1 細菌耐藥性結果

3.4 致病性試驗 試驗組小鼠分別在8～16 h內發病死亡，剖檢后從小鼠體內分離到病原菌，對照組5只小鼠健康存活。結果表明，該分離菌株具有一定的致病性。

4 討論

大腸桿菌可導致山羊嚴重的疾病，致死性高，對羔羊危害嚴重。從陜西省某規模化絨山羊養殖場羔羊腹瀉病料中分離鑒定到3株革蘭陰性桿菌，命名為EG-1、EG-2和EG-3，從形態學觀察、培養特性及生化試驗鑒定結果等方面和《伯杰細菌鑒定手冊》的報道一致，證實分離株為大腸桿菌。將分離株(1×108CFU/mL)腹腔注射小鼠后，小鼠在8～16 h內發病死亡，剖檢后從死亡的小鼠體內分離到病原菌。小鼠感染試驗證實了該分離株具有一定的致病性，且是引起該羊場羔羊腹瀉的主要病原菌。2018年,姜德相等[12]于白城地區采集的127份腹瀉羔羊糞便樣品中，分離鑒定到56株致病性大腸桿菌，也都具有較強的致病性。本試驗結果與武庭斌[13]、陳顥等[14]的報道一致。說明致病性大腸桿菌是引起羔羊腹瀉的主要病原菌，應該加強防范并注意防控措施，同時要做好病原菌的診斷，及時作出科學合理的應對措施。

大腸桿菌抗原結構復雜，血清型較多，不同地區的大腸桿菌分離株血清型不一樣，并且具有地區性特征，加之不同血清型大腸桿菌之間缺乏有效的交叉免疫保護，從而給大腸桿菌病的有效防治增加了難度[15]。本試驗中3株致病性大腸的血清型分別為O119型(EG-1)、O24型(EG-2、EG-3)。本試驗結果與譚詩文等[16]2000年報道的貴州地區和姜德相等[5]2018年報道的白城地區導致羔羊腹瀉的致病性大腸桿菌主要血清型一致。然而，馬利青等[17]報道的青海地區引起羔羊腹瀉的大腸桿菌以O8、O26、O55、O78、O86、O101、O111型和 O126型為優勢血清型。因此，不同地區山羊源致病性大腸桿菌血清型存在差異，故搞清楚本地區致病性大腸桿菌的優勢血清型對于有效防制大腸桿菌引起的山羊疾病有著重要的作用。藥敏試驗結果說明，引起該地區羔羊腹瀉的菌株具有較強的耐藥性，應定期對規模化絨山羊養殖場病原進行檢測及藥敏試驗，選擇敏感藥物交替使用，減少細菌耐藥和藥物殘留，促進絨山羊高效健康養殖。除此之外，還應加強飼養管理，搞好環境衛生工作，嘗試使用中草藥、營養添加劑、噬菌體生物制劑、益生菌、抗菌肽等新型生物制品，提高絨山羊免疫力，有效防控疾病的發生和傳播。