Ⅱ型豬細環病毒及Ⅱ型豬圓環病毒雙重熒光定量PCR檢測方法的建立

劉東旭,閆 滿,尹柏雙,苗麗娟,李國江

(1.吉林農業科技學院動物科技學院動物醫學系，吉林 吉林 132101；2.預防獸醫學吉林省重點實驗室，吉林 吉林 132101)

細環病毒(Transfusion transmitted virus或Torque teno virus,TTV)是一種無囊膜的閉合環狀DNA病毒，屬于指環病毒科細項環病毒屬。豬細環病毒(Torque teno sus virus，TTSuVs)廣泛的流行于多個國家。現已證明，該病毒與仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的發生有關[1]。這使得關于TTSuVs在豬群中的感染情況及潛在的致病性成為研究的熱點。而目前對TTSuVs的了解還非常有限，ELISA法和PCR法是目前檢測該病毒的主要方法[2]。但由于TTSuVs的基因變異性高，且不同亞型之間存在交叉的抗體，使得這些方法敏感性低、精確定量差及假陽性率高[3]。國內外學者也建立了TTSuV2和PCV2單項熒光定量 PCR 檢測方法，可以判定初始模板量，具有敏感度高、特異性強、重復性好，而且用時短，也可自動定量分析的優點[4]。但目前針對TTSuV2和PCV2感染的雙重TaqMan熒光定量PCR檢測的方法尚未見報道。

為此，本試驗建立一種能快速檢測TTSuV2，且可同時分析TTSuV2和PCV2的載量與相關疾病關系的檢測方法，為進一步探究TTSuV2在豬群中的感染情況及其潛在致病性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 豬瘟病毒(Swine fever virus，SFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、I型豬細環病毒(Torque teno sus viru 1，TTSuV1)、I型豬圓環病毒(Porcine circovirus 1，PCV1)病料及鑒定病料由吉林農業科技學院豬生態養殖及疫病防控中心保存。

1.1.2 主要試劑 質粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，均購自杭州愛思進生物技術有限公司；病毒基因組提取試劑盒、PCR酶、TaqMan酶、DNA Marker、pMD18-T Simple Vector，均購自TaKaRa公司。

1.1.3 引物和探針 根據GenBank中公布的PCV2(PCV2a：AY754017；PCV2b：HQ202978；PCV2c：AF109398；PCV2d：AY484407)和TTSuV2(TTSuV2a：MG799366；TTSuV2b：GU188046；TTSuV2c：JF694118)序列保守區，分別設計引物及探針(見表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 擴增引物及探針Table 1 Primers and probes

1.2 方法

1.2.1 標準品的制備 按照病毒基因組提取試劑盒說明書提取PCV2和TTSuV2 基因組，應用所設計的引物分別進行普通PCR擴增。其中PCV2擴增程序為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性2 min，57 ℃退火55 s，72 ℃延伸3 min，共31個循環；最后72 ℃延伸3 min。TTSuV2擴增程序為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性2 min，56 ℃退火55 s，72 ℃延伸3 min，共31個循環；最后72 ℃延伸3 min。回收PCR產物與載體連接進行藍白斑篩選，挑取白色菌落進行鑒定及測序。并用分光光度計測量DNA濃度和純度。

1.2.2 雙重熒光定量PCR反應體系及反應條件優化 按照矩陣法對雙重熒光定量PCR的退火溫度和引物及探針濃度進行優化，確定最佳反應體系及條件。雙重熒光定量PCR最佳反應體系為：PremixExTaq(2×) 12.5 μL，P1 1.0 μmol/L，P2 1.0 μmol/L，T1 1.0 μmol/L，T2 1.0 μmol/L，P 1.0 μmol/L，T 1.0 μmol/L，DNA 模板3 μL，水補至20 μL。優化后反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，55.8 ℃退火30 s，35個循環。

1.2.3 雙重熒光定量PCR不交叉反應 將反應分為2組，第1組以PCV2為模板；第2組以TTSuV2為模板，兩組體系中同時含有擴增PCV2、TTSuV2的引物和探針。在已優化好的雙重熒光定量PCR反應條件下進行擴增。

1.2.4 雙重熒光定量PCR特異性試驗 使用本試驗所優化好的雙重熒光定量PCR反應條件及體系，對PEDV、PRRSV、PRV、SFV、PCV1、TTSuV1進行檢測，并以2種病毒標準質粒為陽性對照，以確定該方法的特異性。

1.2.5 雙重熒光定量PCR敏感性試驗 將2種病毒標準質粒分別調整濃度至1×106拷貝/μL，進行連續的10倍梯度稀釋，確定所建立檢測方法的靈敏性。

1.2.6 雙重熒光定量PCR重復性試驗 對不同濃度的標準質粒進行批內和批間實時熒光定量PCR的重復性試驗，每個樣本進行3次重復，對所得的Ct值的平均值、標準差和變異系數進行分析。

1.2.7 雙重熒光定量PCR標準曲線的建立 將標準質粒進行連續5個梯度的100倍倍比稀釋，分別用優化后的反應體系及反應條件繪制標準曲線。

1.2.8 臨床樣品的檢測 以本試驗建立的雙重熒光定量PCR檢測方法與普通PCR檢測方法同步對收集的300份臨床樣品進行檢測。

2 結果

2.1 標準品的制備 以PCV2、TTSuV2特異性引物分別進行PCR擴增，并將擴增結果與克隆載體連接，進行藍白斑篩選及序列測定(見圖1)。測序結果顯示，本試驗建立的PCV2重組質粒與PCV2(PCV2a：AY754017；PCV2b：HQ202978；PCV2c：AF109398；PCV2d：AY484407)同源性為95%～100%，探針P與各亞型的PCV2同源性為100%。PCV2重組質粒與TTSuV2(TTSuV2a：MG799366；TTSuV2b：GU188046；TTSuV2c：JF694118)同源性為95.9%～7.3%，探針T與各亞型的TTSuV2同源性為100%。

圖1 PCV2 與 TTSuV2重組質粒PCR結果Fig.1 PCR results of PCV2 and TTSuV2 recombinant plasmidsM:Marker DL-2 000;1:TTSuV2;2:PCV2

2.2 雙重熒光定量PCR不交叉反應 分別以PCV2和TTSuV2重組質粒為模板，進行雙重熒光定量PCR。結果顯示，PCV2重組質粒在含有TTSuV2引物探針的體系中反應，沒有任何擴增曲線；TTSuV2重組質粒在含有PCV2引物探針的體系中反應，沒有任何擴增曲線。說明這2套引物探針特異性較好，沒有交叉反應。

2.3 雙重熒光定量PCR特異性試驗 分別以PEDV、PRRSV、PRV、SFV、PCV1、TTSuV1基因組為模板，對雙重熒光定量PCR進行特異性鑒定，結果如圖2、3所示。結果表明,本試驗所建立的雙重熒光定量PCR對PCV2及TTSuV2有很好的特異性，與其他豬病毒無交叉反應。

圖2 PCV2的特異性擴增曲線Fig.2 Specific amplification curve of PCV2

圖3 TTSuV2的特異性擴增曲線Fig.3 Specific amplification curve of TTSuV2

2.4 雙重熒光定量PCR敏感性試驗 以連續稀釋的2種病毒標準質粒為模板(1×106～1×101拷貝/μL)，進行敏感性試驗，結果如圖4、5所示。結果表明，建立的雙重熒光定量PCR對2種病毒的最低檢測拷貝數均為1×102拷貝/μL。

圖4 PCV2的敏感度擴增曲線Fig.4 Sensitivity amplification curve of PCV21:1×106拷貝/μL;2:1×105拷貝/μL;3:1×104拷貝/μL;4:1×103拷貝/μL;5:1×102拷貝/μL1:1×106copies/μL;2:1×105 copies/μL3:1×104 copies/μL;4:1×103 copies/μL5:1×102 copies/μL

圖5 TTSuV2的敏感度擴增曲線Fig.5 Sensitivity amplification curve of TTSuV21:1×106拷貝/μL;2:1×105拷貝/μL;3:1×104拷貝/μL;4:1×103拷貝/μL;5:1×102拷貝/μL1:1×106 copies/μL;2:1×105 copies/μL;3:1×104 copies/μL;4:1×103 copies/μL;5:1×102 copies/μL

2.5 雙重熒光定量PCR重復性試驗 對不同濃度的標準質粒進行批內和批間的重復性試驗，結果如表2所示。本試驗所建立的雙重熒光定量PCR批內和批間變異系數均小于2%，具有良好的重復性。

表2 雙重熒光定量PCR重復性試驗Table 2 Repetitive and stability verification of duplex real-time PCR

2.6 雙重熒光定量PCR標準曲線的建立 以1×1011～1×103拷貝/μL標準質粒為模板，繪制雙重熒光定量PCR標準曲線。結果如圖6所示，PCV2和TTSuV2標準曲線相關系數R2分別為0.999 6、0.998 5，表明所建立的雙重熒光定量PCR檢測方法具有良好的線性關系。

圖6 雙重熒光定量PCR標準曲線Fig.6 Standard curve of duplex real-time PCR

2.7 PCV2、TTSuV2雙重實時熒光定量PCR檢測方法的初步應用 以本試驗建立的TTSuV2與PCV2雙重熒光定量PCR檢測方法與普通PCR檢測方法，同時對收集的300份臨床樣品進行檢測。結果如表3所示，在雙重熒光定量PCR中，PCV2單獨感染檢出率為36.0%，TTSuV2單獨感染檢出率為60.0%，2種病毒混合感染檢出率為14.8%。而普通PCR對PCV2單獨感染檢出率僅為11.3%，TTSuV2單獨感染檢出率僅為37.3%，2種病毒混合感染檢出率僅為3.7%。

表3 雙重熒光定量PCR和普通PCR檢測臨床樣品的結果Table 3 Results of clinical samples detected by duplex real-time PCR and common PCR

3 討論

臨床研究表明，豬群單一感染TTSuV2或PCV2均不會引起明顯的臨床癥狀，但豬群混合感染2種病原體時，會促進PMWS的發生。這使得關于TTSuVs在豬群中的感染情況及潛在的致病性成為研究的熱點[5]。且TTSuV2的載量與疾病嚴重程度存在相關性，故對TTSuV2和PCV2進行定量檢測具有較高的臨床價值。

鄭敏等建立的PCV2和PRV雙重TaqMan熒光定量PCR方法，對PCV2的檢測靈敏度是4.5×102拷貝/μL；Lester J.Pérez 等建立的PCV2、PPV、PRV、TTSuV1、TTSuV2多重SYBR Green I 熒光定量PCR方法，對PCV2和TTSuV2的檢測靈敏度是每個反應體系3.65×103～5.05×103拷貝[6]。而本試驗建立的方法能檢測到的PCV2和TTSuV2基因組最低濃度均為1×102拷貝/μL，比常規PCR和基于SYBR Green I的多重熒光定量PCR更加靈敏。影響實時熒光定量PCR方法的靈敏度涉及許多因素，如樣品來源的復雜程度，引物和探針特異性，體系及擴增條件等，其中引物和探針的設計是最重要的關鍵點。引物的長度，GC含量，退火溫度等應盡量一致且避免交叉互補，避免探針和引物間的相互消耗和非特異性擴增[7]。為此本試驗分別設計的PCV2、TTSuV2雙重熒光定量PCR引物和探針，通過DNASTAR軟件分析，確定2個探針，4個引物相互之間不會形成引物二聚體，且探針的退火溫度比引物高出10 ℃左右，為構建此方法的準確性在理論上奠定了基礎。且在引物和探針設計上，本試驗同時分析病毒的多種亞型序列，確保能夠檢測PCV2及TTSuV2的所有亞型，為臨床診斷提供了可靠的檢測工具。

目前國內未見有關于運用TaqMan雙重探針技術同時檢測PCV2及TTSuV2的報道，而本試驗建立的TTSuV2與PCV2雙重熒光定量PCR檢測方法，具有良好的特異性和敏感性，在多種病原體的干擾下，可準確的檢測出2種病毒的存在。且在同一體系中，該方法對2種病毒的熒光信號檢測不存在相互干擾的現象。應用本試驗建立的方法對300份臨床樣品進行檢測，其檢出率明顯的高于普通PCR方法。但由于實驗室仍在進行PMWS病料的收集，不能對TTSuV2與PCV2的載量與相關疾病的關系進行完整的分析，在后續試驗中，將加大特定病料的收集，為進一步認識TTSuV2在豬群中的感染情況及其潛在致病性提供科學依據。