禽腺病毒血清4型TaqMan 熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

羅洋洋，李群輝，林麗苗，周慶豐

(溫氏食品集團股份有限公司 溫氏集團研究院，廣東 新興 527400)

禽腺病毒(Fowl aviadenovirus，FAdV)屬于腺病毒科、禽腺病毒屬的一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，核衣核呈20面體對稱，病毒顆粒直徑為70～90 nm，根據其特異性抗原的不同可分為Ⅰ、Ⅱ群和Ⅲ群[1]。Ⅰ群禽腺病毒根據交叉中和試驗分為12個血清型(FAdV1～12)，其代表株為雞胚致死孤兒病毒(Chicken embryo lethal orphan virus，CELOV)[2-3]。I亞群腺病毒呈全球性分布，嚴重的主要表現為包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)、心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome,HPS)、肌胃糜爛和潰瘍(Gizzard erosion and lceration,GEU)[4-5]。

近年來，由I亞群血清4型感染導致的心包積水-包涵體肝炎綜合征發病較為廣泛[6-9]，由于其發病迅速、且發病和死亡率均較高，對我國家禽養殖造成了較大影響，因此，快速、準確的診斷能夠最大限度的降低養殖場的損失。

本試驗利用熒光定量PCR技術，根據FAdV-4的Hexon基因保守序列設計了1對特異性引物和探針，建立了禽血清4型腺病毒的TaqMan實時熒光定量PCR方法，為禽血清4型腺病毒的早期診斷、臨床樣品的大量檢測以及定量分析提供了重要的技術手段。

1 材料與方法

1.1 毒株及臨床樣品 FAdV-4毒株由本實驗室分離鑒定所得。雞新城疫病毒(Newcastal disease virus,NDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)、雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV)、血清8a型禽腺病毒(Fowl aviadenovirus 8a,FAdV-8a)、血清8b型禽腺病毒(Fowl aviadenovirus 8b,FAdV-8b)，均由廣東溫氏食品集團股份有限公司養禽事業部生產管理室分離保存。臨床樣品均采自廣東區域及周邊疑似發病雞場。

1.2 主要試劑 RaPure Viral RNA/DNA Kits、HiPure Gel Pure Micro Kit，均購自美基生物公司；Plasmid Mini Kit，購自美國Omega Bio-Tek公司；PrimeSTAR Premix、ExTaqPremix、Loading Buffer、RNA-free water、DNA DL-2 000 Marker、T-Vetor pMD19(Simple)、DH-5α competent cell，均購自寶生物工程(大連)有限公司;TaqManTMFast Advanced Master Mix、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systems，均購自Life公司。

1.3 引物和探針的設計 根據NCBI中公布的FAdV-4 的Hexon基因序列的保守區域，設計了1對普通PCR引物和TaqMan熒光定量PCR引物和探針，引物序列及擴增位置見表1。

表1 普通PCR和熒光定量PCR引物

1.4 熒光定量標準品的制備 按照美基生物的RaPure Viral RNA/DNA Kits提取病毒的總核酸，用普通PCR引物擴增Hexon基因的保守區目的片段。擴增體系(50 μL)：PrimeSTAR Premix 25 μL，Primer F/R 2 μL+2 μL，ddH2O 19 μL，DNA 2 μL；反應條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，30個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。將擴增產物克隆至T-Vetor pMD19(Simple)載體上，產物轉化到DH-5α 感受態細胞內，涂于LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上進行藍白斑篩選，提取重組質粒，用微量紫外分光光度計測定其濃度，根據拷貝數換算公式：拷貝數/μL=(質粒濃度×10-9×稀釋倍數×6.02×1023)/(660道爾頓×堿基數)，計算拷貝數。

1.5 FAdV-4 TaqMan 熒光定量PCR反應條件的優化 用構建的標準品質粒作為模板進行反應條件的優化，體系20 μL。分別選擇0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/L和0.5 μmol/L的引物終濃度，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8μmol/L和1.0 μmol/L的探針濃度和56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃和60 ℃的退火溫度進行TaqMan熒光定量PCR反應，獲得最低的Ct值和最高的熒光強度增加量(△Rn)時的反應條件為最佳反應條件。

1.6 標準曲線的建立 將制備的重組質粒標準品進行10倍梯度稀釋，選取7.3×108、7.3×107、7.3×106、7.3×105、7.3×104拷貝/μL和7.3×103拷貝/μL 的標準品作為模板，設立陰性對照，重復3次，按照優化的最佳條件進行TaqMan熒光定量PCR反應，獲得其標準曲線。

1.7 特異性試驗 利用構建的定量PCR方法，對NDV、AIV、IBV、ILT、IBDV、FPV、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-4進行檢測，檢驗該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗 以各稀釋梯度(7.3×108～7.3×101拷貝/μL)的標準品質粒作為模板進行TaqMan熒光定量PCR和普通PCR檢測，確定能檢出的最低濃度，比較2種方法的敏感性差異。

1.9 重復性試驗 選取標準品中7.3×108、7.3×107、7.3×106、7.3×105、7.3×104拷貝/μL和7.3×103拷貝/μL共6個梯度的樣品作為模板，每個樣品做3個重復檢測，并分別以上述6個稀釋梯度的標準品為模板，分3次進行熒光定量PCR檢測，根據Ct值計算批內和批間的變異系數，評價該方法的重復性。

1.10 臨床樣品的檢測 從廣東省10個養雞場采取50份FAdV-4疑似發病雞只的肝臟，提取其核酸，分別進行普通PCR和TaqMan熒光定量PCR檢測，計算2種檢測方法的陽性率并進行比較。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的制備 利用引物FAdV-4 F1/R1對Hexon基因的目的片段進行擴增，將其克隆至T-Vetor pMD19(Simple)載體上，成功構建重組質粒。提取的重組質粒DNA濃度為335 ng/μL，經公式計算其拷貝數為7.3×1010拷貝/μL。

2.2 TaqMan 熒光定量PCR反應條件的優化及標準曲線的建立 經條件優化表明：采用0.2 μmol/L的引物終濃度和0.2 μmol/L的探針終濃度，退火溫度選擇60 ℃，可使反應獲得最低的Ct值和最高的熒光強度增加量(△Rn)。標準品濃度從7.3×103～7.3×108拷貝/μL共6個梯度為擴增模板，得到良好的線性關系。標準曲線方程式為：Ct=-3.681 lgX+42.984，相關系數R2=0.997。

圖1 FAdV-4熒光定量PCR標準曲線Fig.1 Standard curve of TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR assay for the detection of FAdV-4

2.3 特異性試驗 利用構建的熒光定量PCR方法對FAdV-4、NDV、AIV、IBV、IBDV、ILTV、FPV、FAdV-8a和FAdV-8b 進行熒光定量PCR檢測。結果顯示：只有FAdV-4有明顯的擴增曲線，其他8種病毒無明顯的熒光信號(圖2)。表明該方法特異性良好，同上述病毒無交叉反應。

圖2 FAdV-4熒光定量特異性試驗Fig.2 Specificity test of TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR assayA：FAdV-4；B：AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、FPV、FAdV-8a、FAdV-8b和陰性對照A:FAdV-4;B:AIV,NDV,IBV,IBDV,ILTV,FPV,FAdV-8a,FAdV-8b and negative control

2.4 敏感性試驗 分別以各梯度的標準品為模板進行熒光定量檢測，結果顯示，最小檢出的梯度為7.3×101拷貝/μL(中插彩版圖3)；再以相同梯度的標準品進行普通PCR檢測，結果顯示，可檢出的最小梯度為7.3×103拷貝/μL(圖4)。表明本試驗構建的熒光定量PCR方法比普通PCR敏感性提高了100倍。

圖4 FAdV-4普通PCR敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of conventional PCR assayM:DNA Marker;1～8:重組質粒濃度為7.3×108～ 7.3×101拷貝/μL;9:陰性對照M:DNA Marker;1～8:Recombinant plasmid diluted from 7.3×108～ 7.3×101copies/μL;9:Negative control

2.5 重復性試驗 對同一批次稀釋的5個標準品分別進行批內和批間重復性試驗。結果顯示，批內和批間試驗的標準差均小于0.5，變異系數均小于2%，表明本試驗構建的TaqMan熒光定量PCR方法的重復性良好。

2.6 臨床樣品的檢測 對采集的50份疑似發病樣品用熒光定量和普通PCR進行檢測，結果顯示，用本試驗構建的TaqMan熒光定量方法檢出16份陽性樣品，而普通PCR僅檢出11份陽性樣品，且普通PCR方法同熒光定量的符合率達到100%。由此可見，本試驗建立的TaqMan熒光定量PCR具有更高的靈敏度。

3 討論

2015以來，我國各地陸續暴發了心包積水-包涵體肝炎綜合征，該病主要發生于3周齡以上的肉雞，包括 817、肉雜等品種，自然發病日齡最小的為 7 日齡，發病后4～8 d為死亡高峰，病程為 8～15 d，死亡率20%～80%不等。發病日齡越小，死亡率越高。同時 20～70日齡以及 200～300 日齡的蛋雞也有發生該病，但死亡率低于肉雞，后被證實為I亞群血清4型禽腺病毒感染[10-11]。在此之后，多個品種的鴨也分離到了FAdV-4[12-13]，給國內的養禽業帶來巨大的經濟損失。因此，早期快速、準確的診斷成為防控該病的重要環節，在很大程度上能夠降低經濟損失，所以建立快速、準確、靈敏、穩定的檢測方法顯得尤為迫切。

表2 FAdV-4熒光定量批內重復試驗

表3 FAdV-4熒光定量批間重復試驗

目前對于FAdV-4的檢測主要靠傳統的PCR方法。眾所周知，傳統的PCR方法需要經過核酸提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、基因測序等相對繁瑣的步驟，且靈敏度相比實時熒光定量PCR方法要低[14]。熒光定量PCR技術發明以來，由于其快速、敏感、特異、實時等一系列優點已被廣泛應用于疾病診斷和檢測。六鄰體(Hexon)是禽腺病毒目前研究最廣泛的蛋白，是主要的衣殼蛋白，含有型、群、亞群特異性抗原決定簇[15]。本試驗利用熒光定量PCR技術，根據FAdV-4六鄰體基因的保守區域設計特異性引物和探針，建立了FAdV-4的TaqMan熒光定量PCR方法。

用建立的TaqMan熒光定量PCR方法對其他家禽常見病原進行特異性驗證，結果顯示，無其他非特異性擴增曲線；靈敏性試驗顯示，該方法可檢出的最小病毒濃度為7.3×101拷貝/μL，是普通PCR靈敏度的100倍；批內和批間重復性試驗的變異系數均小于2%，表明該方法具有良好的特異性、靈敏性和重復性。除此之外，TaqMan熒光定量PCR方法無需通過電泳即可得出結果，既能縮短臨床樣品檢測的時間，也可避免操作繁瑣而造成的樣品污染，同時降低了操作人員接觸有毒物質的風險。