豨薟草提取物對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織損傷及NOX2/ROS/NF-κB通路的影響

董樺，李桂華，趙娜，杜書(shū)浩

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是中老年人群最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎，其發(fā)病特點(diǎn)以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷、破壞、關(guān)節(jié)軟骨邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生及骨贅形成為主[1]。目前KOA的西醫(yī)治療主要包括非甾體藥物抗炎鎮(zhèn)痛、腔內(nèi)注射、關(guān)節(jié)鏡介入以及截骨術(shù)、關(guān)節(jié)置換術(shù)等。西醫(yī)治療起效快，但不容易兼顧“經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、長(zhǎng)期有效”的治療目標(biāo)。相比之下，傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎在經(jīng)濟(jì)療效綜合效益方面有一定的優(yōu)勢(shì)[2]。豨薟草是治療關(guān)節(jié)骨痛的傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨之效，常用于治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。現(xiàn)代藥理研究表明，豨薟草中的有效化學(xué)成分二萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等，具有較好的抗氧化應(yīng)激效果，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[3，4]。NADPH氧化酶2(NOX2)/活性氧(ROS)/核因子κB(NF-κB)通路是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路，在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[5]、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[6]等多種關(guān)節(jié)骨病中促進(jìn)病情發(fā)展。目前關(guān)于豨薟草治療骨關(guān)節(jié)炎的報(bào)道較少。2019年8～11月，我們采用豨薟草提取物對(duì)KOA大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理?yè)p傷的影響，并探討其與NOX2/ROS/NF-κB通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量210～230 g，(21±2)周齡，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鼠房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度21～24 ℃，濕度50%～60%，循環(huán)照明模擬晝夜(12 h/12 h)，正常飼喂。

1.1.2 豨薟草提取物制備 豨薟草飲片購(gòu)自廣州南北行中藥飲片有限公司。將飲片粉碎成粗粉，加入75%乙醇，反復(fù)加熱回流提取，過(guò)濾。將濾液稀釋10倍，減壓蒸餾獲得濃膏，再在冷凍干燥機(jī)冷阱中超低溫脫水，獲得棕黃色固形物。粉碎后取5 g溶于100 mL生理鹽水，配制成50 mg/mL的溶液。

1.1.3 試劑與儀器 骨組織番紅和固綠染色液(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；ROS指標(biāo)丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(M-MLV)、BCA濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗NOX2多克隆抗體、兔抗NF-κB多克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(英國(guó)Abcam公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，RT-PCR儀(瑞士羅氏公司)。

1.2 動(dòng)物分組與模型制作 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組以及豨薟草低、中、高劑量組，每組15只。采用碘乙酸鈉誘導(dǎo)構(gòu)建KOA模型[7]。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，向雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔注射50 μL碘乙酸鈉生理鹽水溶液，假手術(shù)組注射等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第4、7、11、14天重復(fù)上述步驟。除注射碘乙酸鈉當(dāng)天外，其余時(shí)間均進(jìn)行轉(zhuǎn)輪鍛煉，轉(zhuǎn)輪速度設(shè)置為7 r/min，鍛煉時(shí)長(zhǎng)30 min/d。實(shí)驗(yàn)第18天結(jié)束鍛煉，完成建模。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)解剖中觀察到膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙狹窄，關(guān)節(jié)平面粗糙且邊緣粗糙有骨贅生成，表明建模成功。

1.3 干預(yù)方法 造模成功后，豨薟草低、中、高劑量組分別給予75、150、300 mg/kg豨薟草提取物經(jīng)口灌服，假手術(shù)組和模型組給予1.2 mL生理鹽水經(jīng)口灌服，1次/d，連續(xù)3周。結(jié)束給藥24 h后，每組15只大鼠中隨機(jī)取6只用于組織學(xué)鑒定，其余9只用于MDA、SOD、NOX2、NF-κB檢測(cè)。

1.4 膝關(guān)節(jié)軟骨損傷評(píng)價(jià) 大鼠麻醉，沿體中線開(kāi)胸，暴露心臟。將灌流針頭插入左心室，剪破右心房上端腔靜脈。打開(kāi)灌流泵，先快速灌入150 mL生理鹽水，待心房流出清水樣液體后，慢速灌入4%多聚甲醛。取出后肢雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，加入4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣處理4周。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，將脛骨平臺(tái)外側(cè)軟骨下松骨質(zhì)和股骨外側(cè)髁軟骨下松質(zhì)骨沿下肢縱軸方向切片，切6 μm厚切片。將切片脫蠟至水，先滴加固綠染液處理3 min，蒸餾水沖洗；然后滴加媒染劑處理30 s，蒸餾水沖洗；最后滴加番紅染液處理1 min，蒸餾水沖洗。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，白光明場(chǎng)拍照。采用13分制，依據(jù)軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分布、組織著色程度及潮線情況進(jìn)行Mankin分級(jí)評(píng)分[8]。

1.5 膝關(guān)節(jié)軟組織MDA含量和SOD活性檢測(cè) MDA含量檢測(cè)采用硫代巴比妥酸法，SOD活性檢測(cè)采用氮藍(lán)四唑法。大鼠斷頸處死，撥開(kāi)雙側(cè)后肢皮膚，切下膝關(guān)節(jié)軟骨，放于EP管中低溫保存。取冷凍組織研磨成組織勻漿，取0.1 g勻漿加入檢測(cè)試劑盒中的提取液，冰浴混勻。4 ℃離心10 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 膝關(guān)節(jié)組織NOX2、NF-κB mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織，使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，分光光度法測(cè)定總RNA含量，純度符合要求后，使用cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，90 ℃ 5 s，4 ℃ 15 s。引物序列：NOX2上游引物5′-CCAGTGAAGATGTGTTCAGCT-3′，下游引物5′-GCACAGCCAGTAGAAGTAGAT-3′；NF-κB上游引物5′-TTGGATTTTCCACAGCCGTAG-3′，下游引物5′-AGAGTTACCTGGCCTGCAGG-3′；GAPDH上游引物5′-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3′，下游引物5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3′。以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：90 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NOX2、NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 膝關(guān)節(jié)組織NOX2、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)。向勻漿組織中加入蛋白提取液，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白含量和純度。取蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉。分別加入一抗(稀釋比例：兔抗NOX2為1∶100，兔抗NF-κB和兔抗GAPDH均為1∶200)，0 ℃孵育過(guò)夜。加入二抗(稀釋比例為1∶100)室溫孵育30 min。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色，凝膠成像儀曝光、拍照，Image Pro Plus6.0軟件分析電泳條帶，計(jì)算IOD值。以目的條帶與內(nèi)參條帶IOD比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組膝關(guān)節(jié)Mankin評(píng)分比較 假手術(shù)組、模型組以及豨薟草低、中、高劑量組的Mankin評(píng)分分別為(0.83±0.47)、(10.32±0.87)、(7.62±0.92)、(5.85±1.09)、(3.06±0.65)分。與假手術(shù)組相比，模型組Mankin評(píng)分升高；與模型組相比，豨薟草各劑量組Mankin評(píng)分均降低，其中高劑量組低于中、低劑量組(P均<0.05)。

2.2 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織MDA含量和SOD活性比較 見(jiàn)表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織MDA含量和SOD活性比較

2.3 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織NOX2、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。

表2 各組膝關(guān)節(jié)組織NOX2、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

2.4 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織NOX2、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。

表3 各組膝關(guān)節(jié)組織NOX2、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

KOA屬中醫(yī)學(xué)“痹癥”和“膝痹”范疇。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，KOA發(fā)生的機(jī)制為“風(fēng)寒濕合，經(jīng)絡(luò)阻滯”，治療以活血化瘀、宣痹通絡(luò)為主[9]。豨薟草性味苦寒，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨之效，能通經(jīng)活絡(luò)、行痹止痛，與KOA證型相合。此外，豨薟草提取物中的生物活性成分二萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等具有鎮(zhèn)痛消炎、抗氧化應(yīng)激的效果，可改善骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)癥狀[10]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，豨薟草不同劑量組Mankin評(píng)分均降低，其中高劑量組低于中、低劑量組,表明豨薟草提取物能夠顯著改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的組織病理?yè)p傷，高劑量組效果更佳。

研究顯示，氧化應(yīng)激可直接導(dǎo)致骨損傷和骨細(xì)胞凋亡，關(guān)節(jié)滑膜炎癥，影響軟骨細(xì)胞合成代謝，導(dǎo)致軟骨退化，是KOA病情發(fā)展的一個(gè)重要因素[11，12]。氧化應(yīng)激是機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的自由基、ROS、活性氮，使內(nèi)環(huán)境的氧化還原平衡被破壞的現(xiàn)象。ROS是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，也是反映氧化應(yīng)激程度的主要指標(biāo)。活細(xì)胞中ROS可以通過(guò)二氯二甲基硅烷熒光染色直接測(cè)定，而在組織中ROS主要是通過(guò)氧化(如MDA)和抗氧化(如SOD)指標(biāo)間接反映。其中MDA與ROS呈負(fù)相關(guān)，SOD與ROS呈正相關(guān)，因此推測(cè)MDA上升而SOD下降時(shí)ROS上升，反之亦然。ROS在炎性發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，其可作為第二信使激活NF-κB等炎性信號(hào)通路上的關(guān)鍵因子，進(jìn)而導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些炎癥因子能激活未成熟的破骨細(xì)胞侵蝕骨質(zhì)，干擾軟骨細(xì)胞代謝促使軟骨降解產(chǎn)生不可逆的纖維化，從而加重KOA[13]。本研究結(jié)果顯示，豨薟草不同劑量組MDA水平低于模型組，SOD水平高于模型組，且高劑量組的變化程度較中、低劑量組更明顯，表明豨薟草提取物能有效抑制大鼠膝關(guān)節(jié)組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，高劑量組效果更佳。

NOX2/ROS/NF-κB通路是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路。NOX是ROS過(guò)量產(chǎn)生的關(guān)鍵跨膜蛋白，NOX2是NOX的典型代表，在巨噬細(xì)胞中表達(dá)豐富。機(jī)體靜息狀態(tài)下，除吞噬細(xì)胞中NOX2不會(huì)活化生成ROS外，其他細(xì)胞中NOX都有一定的活化，作為信號(hào)分子和基因開(kāi)關(guān)維持細(xì)胞正常的增殖分化凋亡；在病原體、炎癥介質(zhì)、機(jī)械損傷等作用下，細(xì)胞NOX大量轉(zhuǎn)錄激活，產(chǎn)生大量ROS，參與機(jī)體的宿主防御[14]。隨著KOA病情發(fā)展，滑膜和脂肪墊巨噬細(xì)胞隨之增多，加重膝骨關(guān)節(jié)損傷、滑膜炎和軟骨損傷。Sakurai等[15]報(bào)道，滑膜巨噬細(xì)胞通過(guò)增加炎性介質(zhì)，加重對(duì)環(huán)氧合酶抑制劑耐藥的晚期關(guān)節(jié)炎的疼痛程度。Marlein等[16]報(bào)道，NOX2異常升高可促進(jìn)骨髓脂肪和破骨細(xì)胞生成，參與有害的骨重塑過(guò)程。因此推測(cè)，抑制NOX2/ROS/NF-κB通路可能改善膝骨關(guān)節(jié)炎。本研究結(jié)果顯示，豨薟草不同劑量組NF-κB、NOX2 mRNA及蛋白水平均低于模型組，且隨劑量增大而降低；而SOD水平高于模型組，隨劑量增大而升高。由此可見(jiàn)，豨薟草提取物劑量能抑制NOX2/ROS/NF-κB通路激活，從而抑制大鼠膝關(guān)節(jié)組織的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，減輕膝關(guān)節(jié)組織病理?yè)p傷，對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎具有顯著治療效果。