將DNA損傷修復實驗引入細胞生物學實驗教學初試

雷曹琦，謝志雄，李小燕

（武漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430072）

實驗教學是細胞生物學課程體系的重要組成部分，是對細胞生物學理論課程的重要支撐，有助于學生掌握理論基礎知識，訓練探索科學的方法，激發學習興趣，培養手腦并用能力及實事求是的科學作風和嚴謹的科學態度。因此，不斷改進實驗教學方法和教學內容，是相關課程實驗教學教師應長期關注和探討的課題。

進入21世紀以來，生命科學取得了巨大進步和迅速發展，已經成為自然科學的前沿學科。大量研究成果的出現及相關知識和信息的井噴式增長，不斷地革新著我們對生命的理解和認識[1-4]。這些不斷出現的新成果和新知識，不僅為生物學教學工作注入源源不斷的素材，也是對教學工作者的挑戰，只有及時更新和完善教學內容和教學方法，才能使教學工作跟上生命科學發展的步伐[5-7]。

為了跟蹤生命科學研究前沿，將當前生命科學研究熱點引入課堂，將大大提升學生的學習積極性。筆者在細胞生物學實驗教學內容中引入“DNA損傷修復實驗”，取得了良好的教學成果。

1 將科學研究熱點與一流教學平臺結合

DNA損傷修復是細胞內DNA分子在受到外源或內源損傷后，在多種蛋白共同作用下自我修復從而恢復結構的過程。DNA損傷修復研究對研究基因組不穩定性及腫瘤的發生與發展具有重要的指導意義，其中關鍵信號分子的靶向小分子藥物研究，對于腫瘤治療具有極其重要的臨床意義。例如，在臨床中運用PARP1抑制劑來抑制PARP1介導的DNA修復，對于腫瘤尤其是BRCA1/2基因突變引起的腫瘤，具有極好的治療效果，已在臨床上廣泛使用[8-9]。由于DNA損傷修復研究在腫瘤研究和腫瘤治療過程中具有重要作用，已成為各國重點投入的熱點研究學科。2015年度諾貝爾化學獎授予托馬斯·林道爾（Tomas Lindahl）、保羅·莫德里奇（Paul Modrich）和阿奇茲·桑卡（Aziz Sancar），就是表彰他們在 DNA修復機制方面的研究貢獻。將DNA損傷修復研究引入細胞生物學實驗教學，能夠使學生切身體會和感受生命科學研究的前沿科學問題，激發他們探究生命奧秘的信心。

我校生物學實驗教學中心是我國首批建設的國家級實驗教學示范中心，擁有一流的實驗教學設備和實驗教學隊伍。在多年的教學過程中，中心改變了實驗教學依附于理論課教學的模式，全面整合教學內容，強化基本實驗技能訓練，以能力培養為主線，重點培養學生的科學研究能力和科學思維能力，以及良好的科學研究素養。中心目前已建成多個綜合型實驗教學實驗室，實驗設備先進、功能齊全，除了完成基本教學任務外，已經具備供學生進行系統性科學實驗探索的能力，是本項實驗教學改革工作的堅實保障。

2 教學改革目標

（1）培養學生提出問題和解決問題的能力。鑒于本項實驗教學所提出的問題是開放性的，在課程前期主要是讓學生按照教師提出的實驗方法學習 DNA損傷修復研究的主要手段。在學生理解相關的基本原理并掌握主要研究方法之后，重點引導學生自己尋找課題，解決關于 DNA損傷修復方面的科學問題。這一學習過程有助于培養學生提出科學問題并用所學知識加以解決的能力。

（2）在教學中添加研究元素。原有的細胞生物學實驗教學主要是使學生了解和掌握一些經典的實驗技術和手段，每個實驗都相對獨立。本項實驗教學則使學生在掌握 DNA損傷修復經典研究技術的基礎上，能夠解決一個自己感興趣的科學問題。使學生由被動接受知識變為主動解決問題，提高學生的學習主動性和積極性。

（3）引入細胞信號轉導教學內容。目前，細胞信號轉導研究是生命科學研究的熱點，而原有實驗教學基本不包括細胞信號轉導方面的實驗。本項實驗教學將使學生直觀感受細胞在受到損傷信號后所發生的變化，并檢測DNA修復蛋白在DNA損傷位點的遷移及所形成的foci結構。

3 實驗設計

3.1 實驗原理

DNA損傷修復是指生物細胞內的DNA分子受到內源或者外源損傷后結構的恢復現象，是機體細胞內的多種酶和信號分子共同作用的結果。當 DNA發生損傷時，組蛋白H2Ax的Ser139位點會被磷酸化修飾，并且會將DNA修復蛋白招募到細胞核內DNA的損傷位點，從而對DNA損傷進行修復。DNA損傷有多種形式，其中最為嚴重的一種是 DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break, DSB）。DSB發生后，細胞需要快速采取措施停止或推遲細胞分裂，為 DNA修復提供足夠時間。真核細胞主要通過兩種途徑修復DSB：同源重組（homologues recombination，HR）和非同源末端鏈接（nonhomologues end joining，NHEJ）。其中，修復蛋白53BP1能夠在DNA損傷發生后被快速招募到DNA損傷位點，從而介導NHEJ修復過程。DNA損傷誘導53BP1的招募，可以通過熒光顯微鏡進行觀察，從而檢測DNA損傷修復過程的發生[10-12]。

3.2 實驗材料準備

HeLa細胞，2 cm細胞培養皿，1.5 cm細胞爬片，DMEM培養基，PBS，青霉素和鏈霉素，DAPI染料，熒光顯微鏡，載玻片，喜樹堿（CPT），抗體，抗癌類藥物或者小分子化合物。所需實驗材料由學生決定，實驗教學中心幫助解決。

3.3 實驗步驟

（1）準備細胞（HeLa cell），每個小組 2位同學，準備3皿細胞（提前一天種細胞爬片，由教師負責）；

（2）DNA損傷修復實驗原理和研究前沿介紹（在普通實驗室完成）；

（3）在細胞無菌操作室將 CPT或各自準備的化合物按照各組自行設計的方案加入細胞中；

（4）將細胞培養皿交給教師，放置于細胞培養箱培養2 h；（5）細胞培養皿用1 mL的PBS洗3次，2 min/次；（6）將0.3mL、4%的甲醛（用磷酸鹽緩沖液PBS配置而成），室溫孵育10 min；

（7）用1 mL的PBS洗3次，2 min/次；

（8）用0.1%的Triton X-100（用PBS配置而成）在室溫孵育5 min，300 μL/片（注意滴加在蓋玻片上，下同）；

（9）用1 mL的PBS洗3次，2 min/次；

（10）用馬血清（用細胞培養緩沖液PBST配置而成）在室溫孵育15 min，300 μL/片；

（11）一抗抗體1∶500稀釋（用PBST配置而成），200 μL/片，室溫孵育 1 h；

（12）用1 mL的PBS洗3次，2 min/次；

（13）二抗抗體1∶100稀釋（用PBST配置而成），200 μL/片，室溫孵育40 min（此步驟及以后步驟均需要遮光處理）；

（14）用1 mL的PBST洗3次，1 min/次；

（15）將 50% DAPI 溶液（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole)+ 50% 抗熒光淬滅封片劑）25 μL滴于潔凈載玻片，反扣；

（16）在熒光顯微鏡下觀察。

3.4 結果與分析

圖1為CPT誘導細胞DNA損傷修復的觀察，其中上、下兩組分別為對照組和加入CPT的實驗組，左側為53BP1熒光顯色圖，右側為DAPI核酸染色圖。如圖1所示，CPT處理HeLa細胞2 h后，能夠在熒光顯微鏡下觀察到53BP1 foci的形成，說明CPT對誘導細胞 DNA損傷的形成具有很強的作用。在沒有通過 CPT處理的 HeLa細胞中，部分細胞能夠檢測到53BP1 foci的形成，說明在正常的細胞中，有源發性的DNA損傷發生。實驗還檢測了其他藥物或化合物，發現很多化合物都不能促進 DNA損傷修復的發生。實驗還發現，大多數抗腫瘤藥物都能引起細胞的凋亡或死亡，這些藥物的副作用和藥物作用特異性引起學生關注，激發了他們進一步探究的興趣。

圖1 CPT誘導細胞DNA損傷修復的觀察

在本項實驗中，學生基本上都能順利完成所有實驗，取得了比較好的實驗效果。但也有學生由于所加藥物毒性太大，或藥物濃度過高，導致細胞大量死亡，而無法獲得較好的實驗效果。今后將增加細胞藥物耐受性檢測，使學生能夠在適當的藥物濃度下進行實驗，從而獲得更好的教學效果。引入 DNA修復實驗，不僅讓學生接觸了學科前沿，而且使學生又一次得到無菌操作技術、免疫熒光技術訓練，有助于學生更好地掌握細胞生物學基礎實驗技術，為未來讀研或快速開展科研打好基礎。

4 結語

本次教學改革旨在鍛煉學生自己提出問題、設計實驗方案，并用經典的實驗手段解決問題及對實驗結果進行分析的能力，實現課堂教學與大學生創新科研訓練培養一體化。同時，將最前沿的研究熱點和科學問題帶入課堂，能夠使學生了解和設計相關研究項目，極大地提高了學生的課堂參與度與學習興趣，獲取了良好的教學效果。