叉頭框蛋白O亞型3a和p27激酶蛋白抑制劑1在電針促進面神經再生中的作用研究※

鄭紅弟 費 靜 余莉亞 李雷激

(西南醫科大學附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 瀘州 646000)

據流行病學調查顯示，面癱在我國的發病率為每年26～34/10萬人，患病率為每年258/10萬人，據此，我國每年將至少有335萬人患此病[1]，因而，研究面神經損傷的修復具有重要的臨床意義。已有大量臨床報道證實，針灸治療周圍性面癱療效確切。隨著電針的普遍應用，患者的治愈率得到了較大提高[2]，但電針治療周圍性面癱的機制尚不明確。

面神經損傷后修復是多因素綜合作用的結果，目前針對神經營養因子、細胞因子的研究很多，關于細胞周期調節因子在面神經損傷后修復中作用研究尚少見，在坐骨神經損傷后修復中的作用研究多見。叉頭框蛋白O亞型3a(Foxo3a)和p27激酶蛋白抑制劑1(p27 kip1)是重要的細胞周期負性調節因子。Foxo3a是叉頭轉錄因子(Foxo)的一種，Foxo3a轉錄后磷酸化受磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)調節，當Akt途徑被抑制時，Foxo3a被激活，從細胞質導入細胞核，從而阻止細胞增殖，導致細胞死亡[3-4]。p27 kip1是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族的一員，通過抑制激酶活性而抑制細胞周期，對損傷后修復有重要影響[5-6]。Foxo3a可調節下游基因p27 kip1，p27 kip1可抑制細胞周期蛋白D1,使細胞周期停滯在G0/G1期，從而阻止細胞增殖[3，6]。查閱文獻，既往無探究面神經壓榨性損傷后，Foxo3a和p27 kip1在電針促進面神經修復中的作用的相關研究。本實驗旨在研究Foxo3a和p27 kip1在面神經壓榨性損傷大鼠腦橋面神經核團段腦組織中的表達情況以及電針對兩者表達是否存在影響，以進一步探索電針治療周圍性面癱可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD雄性大鼠42只，3～5月齡，體質量250～300 g，由西南醫科大學實驗中心提供，實驗動物合格證號：SYXK(川)2018-065。本實驗通過西南醫科大學倫理委員會審查，批準號：201909-5。

1.1.2 主要試劑 Foxo3a一抗、p27 kip1一抗、β-actin一抗[Abcam，艾博抗(上海)貿易有限公司]，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、蛋白免疫印跡(Western Blot)一抗稀釋液、放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(上海碧云天生物技術有限公司)，增強化學發光法(ECL)超敏發光液(北京博奧森生物技術有限公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 主要儀器 G6805-1A型電針治療儀(青島鑫升實業有限公司)，無菌針灸針(北京天宇科技發展有限公司)，勻漿器(上海安亭科學儀器廠),-80 ℃冰箱、蛋白濃度分析儀(美國Thermo Fisher公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，低溫高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，全自動發光分析儀(上海天能科技有限公司)，石蠟包埋機(蘇州市蘇信凈化設備廠)，石蠟切片機(美國Sigma公司)，恒溫干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)，倒置顯微鏡(中國奧林巴斯有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制作 將42只大鼠按照隨機數字表法分為3組，即正常組6只、模型組18只、電針組18只。正常組不予任何處理，正常飼養；模型組、電針組適應性喂養1周后均采用同樣的方法由同一人獨立完成制作右側面神經上頰支壓榨性損傷模型全過程。10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，右側面部備皮后于口角與耳屏之間做一長約2 cm“弧形”切口，止血鉗鈍性分離皮下組織，暴露面神經上頰支，長約1～2 cm，用蚊式止血鉗滿扣夾持面神經上頰支，持續30 s，松開30 s，再夾持30 s[7]，面神經壓榨完成后逐層縫合切口，消毒周圍皮膚，將大鼠放置于37 ℃加熱墊上復蘇，并分籠在同種環境下飼養，常規預防感染。

1.2.2 干預方法 正常組不做任何處理。模型組每日單獨固定于自制鼠板上30 min，不做任何治療。電針組予電針治療，第1次為術后2 h，將大鼠固定在自制鼠板上，取右側地倉(口角外1.0 cm)、右側頰車(下頜角前上方咬肌最隆起之處)2個穴位配對，選用直徑0.25 mm，長度1.5 cm無菌針灸針，針刺深度5 mm，刺入穴位后接電針治療儀治療。治療儀參數:電流40～50 μA，電壓2 V，頻率18～20 Hz，疏密波，強度以頰肌輕微顫動為宜。15 min后交換配對電極，每次30 min，每日治療1次。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 標本取材 正常組于適應性喂養1周后采用腹腔過度注射10%水合氯醛麻醉后，斷頭法處死大鼠，直接取材。模型組、電針組分別于術后第4、14、28 d取材(每組每個時間點分別隨機抽取3只大鼠)。①Western Blot檢測取材方法：采用腹腔過度麻醉后斷頭處死大鼠，用剪刀剪開大鼠頸背部皮膚后離斷頭顱，鷹嘴鉗咬除顱骨暴露腦組織，右側聽神經根保留以作為術側的標記，去除小腦的四疊體，保留腦橋四疊體區域(腦橋中、下段)，將組織于無菌盤中用磷酸緩沖溶液(PBS)沖洗去除血液后，從上向下分為3塊，每塊厚度不超過3 mm，置于清潔凍存管于-80 ℃冰箱保存。②切片標本取材方法：將模型組、電針組每個時間點剩余的3只大鼠腹腔過度麻醉后固定于自制鼠板，腹部切口暴露腹白線，剪開腹膜找到腹主動脈并結扎，暴露心臟，剪開右心耳，將輸液針自左心室插入主動脈，持續緩慢灌注0.9%氯化鈉注射液至右心耳處流出的液體清亮為止，再繼續予4%多聚甲醛灌注進行預固定。按照Western Blot檢測取材方法進行取材，將取下的腦橋中、下段繼續置于4%多聚甲醛中固定,經過修剪、脫水、透明后浸蠟包埋成石蠟塊。

1.3.2 腦橋中、下段腦組織HE染色觀察 將各組大鼠腦組織石蠟塊切片、展片、45 ℃恒溫箱中烤干，常規二甲苯、乙醇脫蠟至水后依次放入蘇木素溶液染色，再用流水沖去余色，1∶400氨水沖15 s，再用自來水沖洗10 min，入蒸餾水片刻，伊紅染色3 min，低濃度到高濃度酒精依次脫水，入二甲苯透明后滴上中性樹脂，最后蓋玻片封片，將玻片置于倒置顯微鏡下觀察，先于低倍鏡(×100)下找到聚集成團的大多角形面神經元細胞，再于高倍鏡(×200)下觀察神經元細胞的形態，并拍照。

1.3.3 Western Blot檢測 根據蛋白提取液說明書步驟提取各組大鼠腦橋中、下段腦組織蛋白，并使用二喹啉甲酸(BCA)法進行濃度測量后100 ℃蛋白變性10 min，-20 ℃冰箱保存。制備SDS-PAGE凝膠，按照每孔40 μg蛋白量分別加入上樣孔進行電泳分離90 min。然后依次進行轉膜60 min、室溫下脫脂牛奶封閉2 h、TBST緩沖液漂洗干凈，再將膜置于一抗稀釋液Foxo3a(1∶1 000)、p27 kip1(1∶2 000)4 ℃冰箱過夜；第2 d將膜用TBST緩沖液漂洗干凈后再置于二抗[辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG (H+L) 、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L) ](1∶1 000)稀釋液中常溫搖床上孵育60 min，TBST緩沖液漂洗干凈后使用ECL超敏發光液進行發光，全自動發光分析儀顯影后Image J圖像處理軟件處理條帶，測出目的條帶與內參(β-actin)條帶灰度值比值以表示目的蛋白的相對表達量。

1.3.4 免疫組化檢測 各組大鼠腦橋中、下段腦組織石蠟塊切片二甲苯脫蠟至水，再依次進行高壓抗原熱修復、滅活內源性酶、5%牛血清白蛋白(BSA)室溫下封閉20 min，然后于37 ℃恒溫箱中孵育一抗2 h，PBS溶液洗3次，每次5 min，室溫下孵育二抗20 min，PBS浸洗后行DAB室溫顯色10 min，蘇木素復染3 min，最后依次脫水、透明、封片，60 ℃烤箱烘干，顯微鏡下觀察陽性反應細胞數并拍照。免疫組化陽性細胞的標準：胞體直徑約20 μm,神經元細胞漿及軸突內含有棕黃色顆粒。

2 結 果

2.1 一般情況 正常組大鼠精神、食欲正常，體質量較術前增加，觸須運動正常，雙側對稱，鼻尖均居中，雙側眼瞼閉合正常。模型組、電針組大鼠造模后全部存活，未出現傷口感染、傷口不愈合等情況，麻醉蘇醒后術后第1 d觀察所有造模大鼠表現為右側眼瞼下垂、不能閉合，右側胡須節律性擺動消失，鼻尖偏向健側。

2.2 各組大鼠腦橋中、下段腦組織面神經元形態學觀察 正常組低倍鏡(×100)視野下可見聚集成團的大多角形運動細胞面神經元細胞；高倍鏡(×200)下可見面神經元細胞輪廓清晰、結構完整，胞質染色均勻，大而圓的藍色胞核位于細胞中央。模型組低倍鏡視野下見面神經元細胞稍分散，邊界模糊，細胞突起減少，隨著時間推移，第14、28 d細胞數目、細胞突起逐漸增多；高倍鏡下見胞質染色不均勻，核仁不居中。電針組第4、14、28 d在低倍鏡和高倍鏡下的面神經元細胞數目及形態學與模型組呈現出相同的變化趨勢，但同一時間點電針組細胞團較模型組細胞團聚集,邊界更清晰，細胞數目更多，面神經元細胞突起增多(見插1，圖1)。

2.3 各組大鼠腦橋中、下段腦組織Foxo3a、p27 kip1蛋白表達比較 見表1。

表1 各組大鼠腦橋中、下段腦組織Foxo3a、p27 kip1蛋白表達比較

由表1可見，術后第4 d，模型組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達低于正常組(P<0.05)，電針組低于模型組(P<0.05)；術后第14 d，模型組、電針組Foxo3a及p27 kip1蛋白表達均較本組第4 d增高(P<0.05)，但仍低于正常組(P<0.05)，電針組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達低于模型組同期(P<0.05)；術后第28 d，模型組、電針組Foxo3a蛋白表達與正常組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，模型組p27 kip1蛋白表達與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)，電針組p27 kip1蛋白表達與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)，電針組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達與模型組同期比較差異均無統計學意義(P>0.05)，模型組、電針組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達均高于本組第14 d(P<0.05)。模型組、電針組Foxo3a、p27 kip1蛋白表達隨著時間的推移均表現為先下降后上升的趨勢(見圖2)。

圖2 各組大鼠腦橋中、下段腦組織第4、14、28 d Foxo3a和p27 kip1蛋白條帶圖

2.4 各組大鼠腦橋中、下段腦組織面神經元中Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數比較 見表2。

表2 各組腦橋中、下段腦組織面神經元中Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數比較 個，

由表2可見，術后第4 、14 d模型組Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數均低于正常組(P<0.05)，術后第28 d，模型組Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。術后第4 、14 d電針組Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數均低于正常組及模型組同期(P<0.05)；術后第28 d，電針組與模型組Foxo3a陽性細胞數比較差異無統計學意義(P>0.05)，電針組p27 kip1陽性細胞數低于模型組同期(P<0.05)。術后第4、14、28 d模型組、電針組Foxo3a、p27 kip1陽性細胞數后一時間點均高于本組前一時間點(P<0.05)。

正常組大鼠Foxo3a在面神經元中有較高表達，免疫反應陽性信號主要在面神經元細胞質表達。術后第4 d，Foxo3a在模型組、電針組面神經元中均有表達，主要表達在細胞質，細胞核表達少。術后第4、14 d，模型組Foxo3a陽性細胞數均低于正常組，呈現出先下降后上升的趨勢，術后第4 d陽性細胞數最少，隨之逐漸升高，直到術后第28 d，模型組陽性細胞數接近正常組。電針組與模型組相比，術后第4、14 d電針組Foxo3a陽性細胞數均低于模型組；術后第28 d，電針組接近模型組Foxo3a陽性細胞數(見插2，圖3)。

正常組大鼠面神經元細胞中可見p27 kip1陽性表達，且高倍鏡下顯示細胞質及細胞核均可見免疫組化陽性反應信號，細胞質表達強于細胞核。術后第4、14 d，p27 kip1在模型組及電針組面神經元中均有表達，在細胞質及細胞核中均有表達，但細胞核中的陽性表達明顯強于細胞質。與正常組相比，術后第4 、14 d模型組p27 kip1陽性細胞數呈現出先下降后上升的趨勢，術后第4 d陽性細胞數最少，至術后第28 d接近正常組。電針組與模型組相比，相同時間點的電針組均比模型組陽性細胞數低，也呈現出先下降后上升的趨勢，到第28 d，電針組陽性細胞數仍比模型組少(見封3，圖4)。

3 討 論

世界衛生組織(WHO)推薦面癱是針灸最適宜治療的病種之一。目前，電針治療面神經損傷被臨床廣泛應用，并取得了顯著療效。研究表明，急性期電針治療可明顯提高痊愈率、顯效率,療效比單純針刺治療好,能明顯加快面神經傳導和面神經功能恢復,痊愈所需天數明顯縮短[8-10]。但電針治療面神經損傷的具體機制仍處于研究階段。地倉穴位于口角外側，主治口眼斜、流涎、唇齒不收等，穴區深層有面神經頰支及面動脈分布，是治療周圍性面癱最常用的穴位之一；頰車穴位于下頜角前上方咬肌最豐隆處中心點，與地倉穴同屬足陽明胃經穴，主治口眼斜、頰腫、面肌痙攣、流涎等，也為治療面癱的主穴[11]。因此，地倉、頰車常配伍治療口眼斜等病癥。故本實驗采用電針于面神經壓榨性損傷急性期刺激地倉、頰車，觀察電針對大鼠面神經損傷修復的影響。

神經再生修復需要經過一系列復雜的過程，可能涉及再生的微環境，周圍細胞及其產生的不同物質，遺傳因素及機體的應激反應、炎性反應、免疫反應等。據既往研究顯示，神經纖維再生修復的過程涉及細胞的再生及再生過程中一些細胞周期蛋白的調節，Foxo3a、p27 kip1就是其中2種重要的負性細胞周期調節因子[12]。Foxo3a通過PI3K-Akt通路與胞核內結構蛋白14-3-3特異性結合后從細胞核轉運至細胞質，發生泛素化降解從而失去轉錄活性，促進細胞增殖。當PI3K-Akt途徑被抑制時，去磷酸化的Foxo3a大部分進入細胞核，導致細胞凋亡[4，13]。本實驗結果表明，面神經頰支壓榨性損傷后，術后第4 d腦橋組織面神經元中Foxo3a表達量下降，隨時間進展逐漸恢復正常。王友華等[6]研究結果顯示，Foxo3a在大鼠坐骨神經損傷后背根神經節中的表達先下降，再逐漸恢復接近正常，與本實驗結果趨勢一致。Foxo3a表達量下降可能是由于PI3K-Akt通路激活，磷酸化的Foxo3a發生泛素化降解失去轉錄活性，從而促進細胞增殖，這與免疫組化結果面神經損傷后Foxo3a陽性信號主要集中在細胞質以及模型組、電針組陽性細胞數少于正常組相吻合。PI3K-Akt-Foxo3a通路除了調節細胞周期外，在氧化應激方面也發揮重要作用[14]。面神經受到外界損傷后發生周圍組織腫脹、炎癥刺激、面神經缺血缺氧，為抵抗損傷，Foxo3a表達量應增高，但本實驗結果顯示術后第4 d模型組及電針組均較正常組低，可能系此階段Foxo3a下降發揮細胞周期調節效應大于炎癥刺激使Foxo3a蛋白表達增高的效應，故綜合兩效應最終表現為Foxo3a在腦橋中、下段腦組織面神經元中表達量下降，但電針組較模型組Foxo3a下降更顯著，可能是因為電針治療使面神經周圍腫脹減輕，炎癥刺激降低，導致Foxo3a升高抵抗炎癥及應激的效應比模型組低。因此，推斷面神經損傷后，電針可以促進面神經元中Foxo3a表達量下降來加速細胞周期，促進神經損傷修復。

p27 kip1參與細胞周期的負性調控。p27 kip1是Foxo3a的下游基因，Foxo3a的活化還能增強具有抑制細胞周期G1期向S期過渡的細胞周期抑制蛋白的表達[15-16]，Foxo3a也可以在核內上調p27 kip1誘導細胞生長周期停滯。且有報道大量細胞株可以通過Foxo轉錄抑制來降低p27 kip1的表達，從而促進細胞增殖[12]，故推測面神經損傷后p27 kip1下降受Foxo3a轉錄水平的調控。本實驗結果顯示,術后第4 d，電針組p27 kip1表達量較模型組、正常組低(P<0.05)。結合Foxo3a在面神經元中的表達趨勢，印證了面神經損傷后p27 kip1下降受Foxo3a轉錄水平的調控的推測。神經損傷后會發生一系列應激反應，面神經元中蛋白會發生很多改變，這些蛋白改變可以幫助神經元細胞對抗外界損傷，減少對自身的損傷，幫助其修復和再生。王巍等[17]研究發現，在面神經損傷后6 h面神經核神經元p27 kip1蛋白表達量即開始升高，損傷后12 h達高峰后逐漸下降，損傷后1周左右面神經核神經元p27 kip1蛋白表達量再次增高，表明面神經核神經元p27 kip1蛋白升高在面神經損傷早期起到抵抗炎癥損傷的作用，后期與面神經修復有關。本實驗測得第4 d模型組p27 kip1低于正常組(P<0.05)，結果與文獻[17]的研究基本一致，電針組比模型組表達量更低(P<0.05)，推斷可能是由于電針緩解了面神經損傷早期的炎癥反應及應激刺激，故與模型組比較，電針組面神經損傷早期p27 kip1升高不明顯，加之Foxo3a的調節使電針組p27 kip1表達量比模型組更低，更有利于神經修復。

綜上所述,電針能加快面神經損傷的修復，其機制可能與綜合調控p27 kip1、Foxo3a表達量從而影響細胞周期有關。