下瘀血湯誘導人肝癌裸鼠移植瘤細胞凋亡的實驗研究※

張 浩 胡佩佩 邵建國 季佩東 蔣 潔

(南京中醫藥大學南通附屬醫院重癥醫學科，江蘇 南通 226000)

原發性肝癌為我國高發的惡性腫瘤之一，發病率位居癌癥第4位，死亡率為第3位[1]。我國原發性肝癌的發生主要與慢性乙型肝炎、脂肪肝、黃曲霉素感染及自身免疫性肝炎相關。如何提高肝癌的早期診斷，提供有效治療，從而提高患者生活質量，延長生存期，成為目前亟需解決的問題。近年，中醫中藥在現代醫學的基礎上，充分發揮優勢，在肝癌治療領域取得了巨大成就，已經被廣泛用于原發性肝癌及肝癌轉移復發的治療。本研究以中醫理論為指導，應用傳統方藥，并結合現代醫學技術，研究下瘀血湯在肝細胞性肝癌治療中的作用及機制。

核仁紡錘體相關蛋白1(Nusap1)是一種新型的55-kd脊椎動物蛋白，是一種重要的微管和染色質結合蛋白，將染色體連接到有絲分裂紡錘體[2]，具有捆綁并穩定微管、防止解聚、保持紡錘體完整性的作用[3]。越來越多的研究證實，Nusap1與肝癌的發生發展密切相關，可以促進肝癌細胞的侵襲轉移，而下調Nusap1的表達后，腫瘤細胞的增殖明顯受到抑制[4]，這些作用可能是通過調控微小RNA-122(miR-122)調控肝癌的進展實現的[5]，因此有望成為肝癌治療的新靶點。此外，有研究顯示，抑制Nusap1的表達，可以明顯抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時可以增強癌細胞對表阿霉素的敏感性[6]。Nusap1還可以通過上調Wnt /β-catenin信號通路促進宮頸癌侵襲、轉移和腫瘤發生[7]。前期研究已證實，下瘀血湯有較好的抑制肝癌細胞體外生長的作用[8]，本研究在前期基礎之上，進一步觀察下瘀血湯對肝癌細胞裸鼠移植瘤增長及Nusap1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性BALB/c裸鼠(4～6周齡)32只，體質量(200±20)g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2018-0008]，飼養于南通大學動物實驗中心，進食配制基礎飼料。

1.2 藥品及試劑 下瘀血湯藥物組成：生大黃6 g，桃仁6.7 g，土鱉蟲11.6 g，由南通市中醫院制劑室煎制，藥液生藥含量為0.4 g/mL；肝癌HepG2細胞，購自中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心；Nusap1及β-actin抗體，購自英國Abcam公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清，購自賽默飛世爾科技公司；胰蛋白酶，購自北京索萊寶科技有限公司；RNAiso Plus，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，購自日本Takara公司；逆轉錄試劑盒qPCR SYBR Green Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Nusap1引物設計由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；細胞凋亡檢測試劑盒，購自美國BD公司；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、麗春紅染色液，購自北京碧云天生物技術公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 儀器 FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)儀(美國BIO-RAD公司)；CO2培養箱(賽默飛世爾科技公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養 HepG2細胞基培養于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，并置于37 ℃ CO2培養箱中，當細胞長至約80%～90%時，采用胰蛋白酶消化細胞，離心機重懸后進行傳代，傳代約第3代后，當細胞處于對數期，生長狀態良好，將對數期細胞收集。

1.4.2 建立肝癌移植裸鼠模型及分組 將0.2 mL(濃度約5×107個/mL)的HepG2細胞注射于所有裸鼠右腋皮下。接種后的裸鼠在無菌環境下飼養，每日記錄觀察成瘤情況。當皮下腫瘤體積>50 mm3時，達到成瘤標準[9]。將造模成功的20只裸鼠按照隨機數字表法分為對照組、下瘀血湯低劑量組、下瘀血湯中劑量組、下瘀血湯高劑量組，每組5只。

1.4.3 灌胃 分組后開始灌胃。下瘀血湯低、中、高劑量組分別予0.15、0.3、0.6 g/20 g下瘀血湯灌胃(具體給藥劑量通過體表面積換算為人小鼠等效劑量為高劑量組，中、低劑量組分別稀釋2倍、4倍[10])，灌胃容積0.2 mL/10 g。對照組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。灌胃均每日2次(8：00，18:00)，連續15 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 成瘤情況 灌胃期間每日觀察祼鼠精神活動及飲食、大小便情況。每3 d測量腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×長徑×短徑×短徑[11]。15 d后停止灌胃，脊椎脫臼法處死裸鼠，割除瘤體，稱取瘤體質量。

1.5.2 流式細胞術檢測移植瘤細胞凋亡 腫瘤組織使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，切取瘤體組織1/4大小，提取瘤體組織細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明，依次加入PE Annexin Ⅴ和7-AAD試劑，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5.3 qRT-PCR檢測Nusap1基因mRNA表達 切取瘤體組織1/4大小，按照RNAiso Plus說明書，通過研磨，提取瘤體組織細胞的總RNA。在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 1 min的條件下按逆轉錄試劑盒說明書行逆轉錄成cDNA。最后通過SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒行qRT-PCR檢測Nusap1基因mRNA的表達量。內參基因為β-actin。通過Power=2-△△CT值計算相對表達量，隨后采用Power值行統計學分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.4 免疫印跡(Western Blot)實驗檢測Nusap1蛋白表達 取瘤體組織1/4大小，將腫瘤組織置于含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液中，于冰上裂解，離心取得蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量，稀釋蛋白至濃度5～10 μg/L。配制分離膠和積層膠，待凝固后進行凝膠電泳分離、轉膜。轉膜成功后予麗春紅染色顯示條帶，剪下晾干。常溫封閉液封閉膜2 h后，加入Nusap1抗體(抗體稀釋比例1∶2 000)，4 ℃冰箱過夜，第2 d加入HRP標記的二抗，暗室內發光、顯影、定影。

2 結 果

2.1 裸鼠情況 初始裸鼠共32只，因飼養不當死亡2只，種植移植瘤后提前死亡4只，因移植瘤生長緩慢未達實驗標準而未納入后續實驗6只，最終造模成功裸鼠20只，每組5只。

2.2 各組裸鼠移植瘤體積比較 見表2。

由表2可見，灌胃第6、9 d，各組裸鼠移植瘤體積組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；灌胃第12 d，下瘀血湯中、高劑量組裸鼠移植瘤體積低于對照組(P<0.05)；灌胃第15 d，下瘀血湯低、中、高劑量組裸鼠移植瘤體積低于對照組(P<0.05)。灌胃第12、15 d，下瘀血湯低、中、高劑量組裸鼠移植瘤體積組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組裸鼠移植瘤體積比較

2.3 各組裸鼠移植瘤平均質量比較 見表3。

表3 各組裸鼠移植瘤平均質量比較

由表3可見，下瘀血湯低、中、高劑量組裸鼠移植瘤平均質量均低于對照組(P<0.05)，下瘀血湯中、高劑量組裸鼠移植瘤平均質量均低于下瘀血湯低劑量組(P<0.05)，下瘀血湯高劑量組裸鼠移植瘤平均質量低于下瘀血湯中劑量組(P<0.05)。見封2，圖1。

2.4 各組裸鼠移植瘤細胞凋亡情況 見圖2、表4。

圖2 各組裸鼠移植瘤細胞凋亡情況

表4 各組裸鼠移植瘤細胞凋亡率比較

由圖2可見，下瘀血湯低、中、高劑量組均可見大量被染色的凋亡細胞，且隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞越多。由表4可見，下瘀血湯低、中、高劑量組移植瘤細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)，下瘀血湯高劑量組移植瘤細胞凋亡率高于下瘀血湯低、中劑量組(P<0.05)。下瘀血湯低、中劑量組移植瘤細胞凋亡率組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 各組裸鼠Nusap1 mRNA相對表達量比較 見表5。

表5 各組裸鼠Nusap1 mRNA相對表達量比較

由表5可見，下瘀血湯低、中、高劑量組Nusap1 mRNA相對表達量均低于對照組(P<0.05)，下瘀血湯高劑量組Nusap1 mRNA相對表達量低于下瘀血湯低劑量組(P<0.05)。下瘀血湯低、中劑量組Nusap1 mRNA相對表達量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，下瘀血湯中、高劑量組Nusap1 mRNA相對表達量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6 各組裸鼠Nusap1蛋白表達 見圖3。

由圖3可見，下瘀血湯低、中、高劑量組可以抑制Nusap1蛋白的表達，且隨著下瘀血湯用藥濃度的增加，這種抑制作用逐漸增強。

圖3 各組裸鼠Nusap1蛋白表達

3 討 論

肝癌被發現時多處于中晚期，失去手術機會，放化療、介入治療又難以取得很好的療效[12]。隨著分子生物學研究的不斷深入，中醫藥與現代分子生物學相結合的研究模式越來越受到關注。中醫藥在治療肝癌方面積累了豐富的臨床經驗，相對于現代醫學，在控制病情進展、延長生存期方面具有獨特優勢。在肝癌的中醫證型中，血瘀證是最主要的證型，血瘀貫穿了肝癌發展的始終[13]。活血化瘀法是肝癌治療的基本治則。活血化瘀法可以降低血液黏稠度，抑制腫瘤瘤栓的形成，改善腫瘤患者局部及全身的高凝狀態，改善微循環，改善組織供氧，防止低氧狀態下腫瘤的惡性增殖[14]。下瘀血湯為活血化瘀劑，由大黃、桃仁、土鱉蟲組成。方中大黃逐瘀通經；桃仁活血化瘀；土鱉蟲除瘀消積。全方共奏破瘀散結、通利臟腑之效。現代藥理研究證實，大黃、桃仁、土鱉蟲均有較好的抗腫瘤作用[15-18]；下瘀血湯對膽堿蛋氨酸缺乏誘導的小鼠非酒精性脂肪性肝炎有較好的抑制作用，該作用可能與調控巨噬細胞NLRP6的表達有關[19]；下瘀血湯在抗肝纖維化方面具有獨特的作用，主要機制包括抑制星狀細胞激活，誘導肝星狀細胞凋亡，抑制血管新生，調控巨噬細胞功能，促進巨噬細胞凋亡及抗氧化等[20]；下瘀血湯還可以抑制胃癌細胞裸鼠移植瘤的生長[21]。

Nusap1是一種高表達于多種癌細胞的腫瘤標志物。近年來研究發現，Nusap1的過度表達是一種潛在的預后不良標志物[22-23]。因此，對Nusap1檢測為臨床腫瘤的定位診斷、預后評估及靶向治療提供了有利條件。目前，對于腫瘤患者仍缺乏有效的治療方法，在分子水平的研究有助于轉化到臨床診斷治療中，進而造?；颊摺?/p>

前期研究表明，下瘀血湯對于肝癌HepG2細胞生長有抑制作用[8]。本研究結果顯示，下瘀血湯能較好地抑制肝癌HepG2移植瘤的生長，且下瘀血湯濃度越高，抑制作用越明顯，抑制腫瘤生長呈濃度依賴性。下瘀血湯低劑量組抑制作用較下瘀血湯中、高劑量組效果略差，但隨著用藥時間的延長，下瘀血湯低劑量組用藥也可以產生較好的抑制腫瘤生長的作用。下瘀血湯可以較好地促進移植瘤細胞的凋亡，且下瘀血湯高劑量組促凋亡作用最強，呈現出藥物劑量和效應相關性。Western Blot及qRT-PCR實驗表明，下瘀血湯可抑制腫瘤組織中Nusap1蛋白及mRNA的表達，抑制作用與用藥濃度相關，濃度越高，抑制作用越明顯。由此我們得出結論，下瘀血湯可抑制肝癌HepG2裸鼠移植瘤的生長，誘導肝癌細胞凋亡，此作用與抑制Nusap1的表達密切相關。