多囊蛋白在成釉細胞瘤的表達及分布研究

侯亞麗，楊 麗，劉 冰，張 昊，李向軍*

(1.河北醫科大學口腔醫學院，口腔醫院病理科，河北省口腔醫學重點實驗室，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學口腔醫學院，口腔醫院口腔頜面外科，河北省口腔醫學重點實驗室，河北 石家莊 050017；3.河北醫科大學口腔醫學院，口腔醫院牙周一科，河北省口腔醫學重點實驗室，河北 石家莊 050017)

多囊蛋白(polycystin,PC)作為一個細胞表面的膜受體，最早在常染色體顯性多囊性腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)的研究中被發現，其家族共有五個成員[1]。研究表明由PKD1基因(polycystic kidney disease 1,PKD1)和PKD2基因分別編碼的多囊蛋白1(polycystin-1,PC-1)和多囊蛋白2(polycystin-2,PC-2)與囊腫的形成有關[2-5]。而且PC-1和PC-2還與多個細胞信號存在相互作用，對腫瘤的發生發展產生一定影響[6]。成釉細胞瘤是一種良性牙源性上皮性腫瘤，具有局部侵襲性和易復發的生物學特性。組織病理學分為實性/多囊型、單囊型、促結締組織增生型及骨外/周圍型成釉細胞瘤。PC-1和PC-2在成釉細胞瘤中的表達和分布如何？目前國內外尚未見報道。本研究采用免疫組織化學方法檢測PC-1和PC-2在成釉細胞瘤中的表達及分布，并與牙源性角化囊腫(odontogenic keratocyst，OKC)相比較，為研究成釉細胞瘤的發生發展機制，尋找新的早期診斷和治療方法提供線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年2月—2019年6月河北醫科大學口腔醫院口腔頜面外科手術切除的成釉細胞瘤標本30例(成釉細胞瘤組)；牙源性角化囊腫標本15例(牙源性角化囊腫組)。成釉細胞瘤組男性19例，女性11例，年齡17～38歲，平均(26.6±6.9)歲；牙源性角化囊腫組，男性10例，女性5例，年齡16～47歲，平均(30.0±10.4)歲。標本制作及切片染色在河北醫科大學口腔醫(學)院口腔醫學重點實驗室及河北醫科大學第二醫院口腔科實驗室完成。所有病例均由兩位高年資病理醫生進行病理診斷并分型。成釉細胞瘤組中實性/多囊型成釉細胞瘤22例：其中濾泡型13例，叢狀型9例；單囊型成釉細胞瘤8例。以上所有病例術前均未進行放療、化療或生物治療并且均有完整的臨床病例資料并隨訪。

1.2實驗試劑 PC-1和PC-2多克隆抗體購自英國 Abcam 公司,PV-9000免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺(3,3′-Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3實驗方法 分別將成釉細胞瘤組和牙源性角化囊腫組標本分切、固定，石蠟包埋，切成3～4 μm切片，常規脫蠟至水。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3 min×3次，放入枸櫞酸緩沖液進行熱修復15～17 min，一抗PC-1和PC-2濃度分別為1∶75和1∶100。以后按PV9000試劑盒說明書操作，DAB染色，蘇木素復染，酸酒精分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照采用已知的陽性組織切片，陰性對照用PBS代替一抗。

1.4結果判定 PC-1和PC-2陽性為細胞漿或細胞膜有淡黃色或棕色顆粒沉積。根據染色強度和腫瘤細胞陽性率評估免疫組織化學得分。選取腫瘤細胞染色陽性密集區域，在高倍鏡下計數100個腫瘤細胞的染色情況。染色強度評分如下：無著色=0分、淡黃色=1分、黃褐色=2分、棕褐色=3分。平均陽性細胞百分率為：<5%為0分、5%～25%為1分、>25%～50%為2分、>50%為3分。細胞染色強度與平均陽性細胞率的評分之和為PC-1與PC-2的免疫組織化學染色最終得分。將評分結果1分定為陰性、2分為弱陽性，3分為陽性，>4分為強陽性。

1.5統計學方法 應用SPSS 21.0統計學軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗及四格表資料的Fisher確切概率法檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PC-1與PC-2在成釉細胞瘤組和牙源性角化囊腫組中的表達 成釉細胞瘤組PC-1與PC-2主要表達于腫瘤的成釉細胞樣細胞及部分星網狀層樣細胞的細胞漿和細胞膜(圖1～2)，尤其濾泡型成釉細胞瘤上皮團塊中央的腫瘤細胞發生鱗狀化生或囊性變時，鱗狀化生和囊腔周邊的細胞PC-1與PC-2呈強陽性(圖3～4)；成釉細胞瘤中PC-2的表達強于PC-1。牙源性角化囊腫組PC-1與PC-2呈現弱陽性或陰性表達(圖5～6)，弱陽性表達主要位于部分牙源性角化囊腫復層鱗狀上皮的棘層、粒層及部分基底細胞，并且纖維囊壁中子囊周邊細胞PC-1與PC-2呈陰性表達(圖7～8)。成釉細胞瘤組PC-1與PC-2的陽性表達率明顯高于牙源性角化囊腫組(P<0.05)，見表1。

表1 PC-1與PC-2在成釉細胞瘤組和牙源性角化囊腫組中的表達Table 1 Expression of PC-1 and PC-2 in ameloblastoma and odontogenic keratocyst groups (例數，%)

2.2PC-1與PC-2在成釉細胞瘤組各病理亞型中的表達 PC-1與PC-2在實性/多囊型和單囊型成釉細胞瘤(圖9～10)中分布和陽性表達率差異均無統計學意義(P>0.05)。在實性/多囊型成釉細胞瘤病理亞型中，濾泡型和叢狀型成釉細胞瘤PC-1和PC-2的分布和陽性表達率差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2～3。

表2 PC-1與PC-2在實性/多囊型和單囊型成釉細胞瘤中的表達 Table 2 Expression of PC-1 and PC-2 in solid/multicystic and monocystic ameloblastoma (例數，%)

表3 PC-1與PC-2在實性/多囊型成釉細胞瘤各病理分型中的表達 Table 3 Expression of PC-1 and PC-2 in solid/polycystic ameloblastoma (例數，%)

3 討 論

成釉細胞瘤是臨床常見的良性牙源性上皮腫瘤，但是由于早期無明顯臨床表現而不易被早期發現?；颊呔驮\時頜骨常常已有大范圍破壞，再加上其侵襲性的生長方式，其治療只能手術切除部分頜骨。但是切除部分頜骨必將影響患者的面容及咬合關系，影響患者的生存質量。因此，深入研究成釉細胞瘤的發生發展機制，探索新的早期診斷和治療方法具有重要意義。

PC是一個受體樣的跨膜蛋白，其位于胞內的羧基端含有3個潛在的酪氨酸激酶磷酸化位點，這提示該蛋白可能在細胞內外信號的傳遞中發揮作用。目前研究主要集中于PC-1和PC-2兩種多囊蛋白異構體。PC-1主要分布于肝臟、腎臟、胰腺、腸、心臟等組織，可表達于上皮細胞、內分泌細胞、心肌細胞和骨骼肌細胞；PC-2主要分布于腎臟、甲狀腺和血管組織中，而肝臟、胰腺、小腸、胃、脾臟、腦組織、食管中則未查及存在[5]。研究表明ADPKD中編碼2種PC的基因突變導致了液體充盈的腎囊腫以及其他上皮器官(包括肝臟和胰腺)的囊腫的產生[7-10]。成釉細胞瘤是口腔頜面部的一種良性牙源性上皮性腫瘤，在組織病理學上常有單個或多個囊腔的形成，但是目前并無研究報道PC是否與成釉細胞瘤的囊腔形成和局部浸潤的生物學特性有關。故本研究采用免疫組織化學方法檢測PC-1與PC-2在成釉細胞瘤中的表達及分布，為研究其發生發展機制，尋找新的早期診斷標記物和新的治療靶點提供線索。

長期以來關于PC對多囊腎、多囊肝以及多囊卵巢的病變形成及發展機制方面學者們作了大量研究。研究發現，PC不僅可以通過多個信號通路如：cAMP、MAPK、Wnt、JAK-STAT、Hippo、Src和mTOR等[11-12]參與調控細胞的生物過程，如細胞凋亡、細胞增殖分化、遷移及囊腔的形成等[13-16]，而且還可以通過對mTOR通路調控腫瘤細胞的增殖[17-18]。腫瘤細胞所處的微環境可調節細胞外基質使其性能改變重塑，進而提高腫瘤細胞局部浸潤和遠處轉移的能力[19]。研究已表明過度表達的PC-1與PC-2還能夠通過mTOR通路促進腫瘤細胞的局部浸潤，并且過表達的PC-1與上皮細胞向間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)有關。有研究表明[20]，大腸癌細胞HCT116中PC-1與PC-2的過度表達可以促進大腸癌的EMT進程，從而在大腸癌的局部浸潤/遠處轉移的過程中起到重要調節作用。目前，EMT在成釉細胞瘤生物學行為中的調控作用也得到了證實：Siar等[21]認為EMT與成釉細胞瘤的局部浸潤有關。本研究結果顯示，PC-1與PC-2在實性/多囊型AB各病理分型中均為明顯高表達，這提示PC-1與PC-2的高表達可能與成釉細胞瘤本身的腫瘤特性有關，PC可能參與成釉細胞瘤的上皮-間質轉化，對其浸潤性生長的生物學行為產生一定影響，但具體機制有待進一步研究。課題組認為，成釉細胞瘤與牙源性角化囊腫盡管在組織病理學上有一定相似性：①病變均有囊腔；②腫瘤中均含有細胞核極性倒置的成釉細胞樣細胞，但兩者本質還是不同的。而且以往認為成釉細胞瘤與牙源性角化囊性瘤均為牙源性上皮性腫瘤，但是2017年WHO對牙源性腫瘤重新進行了分類，將“牙源性角化囊性瘤”改回了以前的“牙源性角化囊腫”的名稱，并將其劃入了囊腫章節，而成釉細胞瘤仍屬于牙源性腫瘤。PC-1與PC-2在大部分牙源性角化囊腫中呈現陰性表達，僅有少量為弱陽性表達，這明顯不同于成釉細胞瘤中的高表達。此結果提示PC-1與PC-2可能與牙源性角化囊腫的形成無明顯關系。此前，研究者曾發現PC-1在含牙囊腫所有上皮細胞均有表達，推測PC-1可能在含牙囊腫和其他牙源性囊腫的發病和進展中發揮作用[22]。本研究結果顯示，成釉細胞瘤中發生鱗狀化生或囊性變的腫瘤細胞PC-1與PC-2呈強陽性表達，而牙源性角化囊腫纖維囊壁中子囊周邊的細胞兩種蛋白的表達卻為陰性。這提示PC-1與PC-2可能和成釉細胞瘤的囊性轉化有一定關聯，但是卻并未為兩種蛋白的表達與囊腫形成提供有力的證據。

目前研究發現，PC-1是一種機械敏感受體，具有受體功能的結構和特征，能夠將機械刺激轉化為細胞內生化信號[23]；而PC-2是一種較小的跨膜蛋白，屬于鈣通道的瞬時受體電位家族，它能夠調節細胞內鈣離子，影響細胞增殖、分化和細胞極性等多種特征[6]。本研究結果顯示，成釉細胞瘤組PC-1與PC-2主要表達于細胞核明顯極性倒置的成釉細胞樣細胞，且PC-2的表達強于PC-1；而兩種蛋白在牙源性角化囊腫組上皮襯里呈極性倒置的基底細胞卻呈陰性或弱陽性表達。推測PC-1與PC-2可能對成釉細胞瘤中腫瘤細胞的功能存在影響，尤其是可能影響腫瘤細胞的極性，但具體機制有待進一步研究。本研究結果顯示，PC-1與PC-2在實性/多囊型和單囊型成釉細胞瘤及實性/多囊型成釉細胞瘤各病理亞型中的分布和陽性表達率差異均無統計學意義。推測這可能是由于實性/多囊型和單囊型成釉細胞瘤病理變化相似，鏡下均由極性倒置的成釉細胞樣細胞和星網狀層樣細胞構成所致。但也不排除此結果與成釉細胞瘤樣本尤其是單囊型成釉細胞瘤樣本較少有關，因此需要擴大樣本來進一步證實。

綜上所述，PC在成釉細胞瘤的表達可能與其發生發展，局部侵襲的生物學特性及成釉細胞瘤的囊性轉化有關，這為探索成釉細胞瘤新的早期診斷和治療方法提供了線索。(本文圖見封三)