嗜麥芽窄食單胞菌耐藥機制及治療策略的研究

藺曉萱，謝立新(綜述)，霍炳杰，王常樂*(審校)

(1.河北醫科大學藥學院臨床藥學2016級，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學基礎醫學院病原生物學教研室，河北 石家莊 050017；3.河北醫科大學第四醫院中醫內科，河北 石家莊 050011)

嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia，SM)屬非發酵型革蘭陰性桿菌，廣泛存在于醫院和自然環境。該菌對多種抗生素天然耐藥，但致病能力較弱，多見于感染免疫力低下及危重患者。SM引起人體感染性疾病的易感因素主要包括機體自身和醫源性兩大類。其中年齡和基礎性疾病屬于機體自身因素?？咕幬锏氖褂脧姸龋瑲夤芮虚_或插管、人工置入器材、引流穿刺等侵襲性操作，以及病患住院時間等可作為導致該菌感染的醫源性因素[1-2]。SM主要引起人體呼吸系統疾病，但也可引起多種臨床綜合征，如菌血癥、心內膜炎、腦炎及尿道感染等，是醫院內感染重要病原體。近年來，該致病菌引起的感染性疾病逐年上升，更由于其天然抵抗多種抗菌藥物，給臨床治療帶來極大困難與挑戰[3]。

1 SM耐藥現狀

當前，SM耐藥現狀令人擔憂。在臨床治療中，該菌對大多數常用抗菌藥物諸如青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、喹諾酮類、碳青酶烯類抗生素亞胺培南、美羅培南等表現出不同程度的抵抗性[3-4]，且不同醫院分離的SM對抗菌藥物的耐藥率不盡相同。筆者認為其中最直接導致耐藥率不同的原因，即標本的來源不同，該原因直接影響著該菌對抗菌藥物的敏感性。血液及無菌體液標本分離出的菌株與尿液和其他分離標本中菌株相比，其耐藥率較低。回顧性研究顯示，自2005—2017年在同一家醫院分離出的3 971株SM對米諾環素、左氧氟沙星、和復方磺胺甲噁唑表現出良好的敏感性，且對左氧氟沙星和復方磺胺甲噁唑的耐藥性分別從16.5%和14.5%降至4.0%和2.9%[5]。但也有研究報道，2017—2018年臨床分離114株SM對復方磺胺甲噁唑的耐藥率達到63.16%，必要時需與米諾環素、左氧氟沙星等聯合用藥以治療SM導致的感染性疾病[6]。

2 SM耐藥機制

SM屬多重耐藥菌，耐藥機制復雜，其所攜帶的耐藥基因可編碼多種相關的酶類物質或功能蛋白。這些酶與蛋白發揮著不同的耐藥功效，進而降低抗生素對自身的危害。其中，β-內酰胺類水解酶和氨基糖苷類修飾酶屬SM分泌的耐藥酶類物質。喹諾酮相關的SmQnr決定因子，以及sme基因家族、emrCABsm、smrA和macABCsm等基因編碼的多重耐藥外排泵屬SM編碼的耐藥功能蛋白。此外，細菌生物膜和可移動基因元件也參與了該致病菌耐藥的形成，進而增強SM對不同類別抗生素的抵抗性。

2.1β-內酰胺類水解酶耐藥機制 革蘭陽性、陰性菌可分泌產生β-內酰胺酶，是致病菌對β-內酰胺類抗生素產生耐藥的主要原因。β-內酰胺類抗生素中的β-內酰胺環是抗菌的活性部位，可阻礙細菌細胞壁的合成，進而使得細胞壁缺損，菌體膨脹而死。SM產生的β-內酰胺酶可以與β-內酰胺環結合，在β-內酰胺類抗生素未與細菌作用靶點部位接觸之前將其水解失活[3]。SM編碼β-內酰胺酶的基因可存在于細菌染色體，也可存在于質?；虿迦胄蛄械然蜉d體，進而能夠在不同SM之間傳遞，從而導致獲得性耐藥現象的發生[7]。

SM能夠分泌產生L1和L2兩種β-內酰胺酶，并分別利用Sec和Tat轉位酶將L1、L2跨越細菌內膜從細胞質中轉運至周漿間隙。L1為金屬β-內酰胺酶，以鋅離子活性位點為中心。除氨曲南外，L1可水解大多β-內酰胺類抗生素。雖然氨曲南不能被L1水解，但SM仍對氨曲南表現出耐藥。因此，該菌或利用其他耐藥途徑對氨曲南產生抵抗作用[8]。L2為絲氨酸活性酶，具有絲氨酸活性位點，主要水解頭孢菌素和單環類β-內酰胺類抗生素，該酶的活性可被碳青霉烯類抗生素亞胺培南誘導產生。L1、L2兩種酶的表達可同時受位于L2基因上游的AmpR基因調節，耐藥程度與兩種酶的表達量有關[3,9]。β-內酰胺酶抑制劑克拉維酸對抑制L1的活性無效，但可抑制L2 β-內酰胺酶。

2.2氨基糖苷類修飾酶耐藥機制 SM分泌與釋放的氨基糖苷類修飾酶是導致該菌對氨基糖苷類抗生素產生耐藥的主要原因之一。氨基糖苷類修飾酶按功能可分為三類：乙酰基轉移酶類、腺苷酰轉移酶類及磷酸轉移酶類。三種酶類物質可通過修飾氨基糖苷類抗生素特定的活性基團，導致與細菌靶位核糖體的親和力降低，從而失去抗菌活性[10]。編碼氨基糖苷類修飾酶的基因分布廣泛，不但存在于致病菌染色體，同樣也存在于細菌質粒的整合子、基因盒、轉座子等元件。其中，I類整合子在氨基糖苷類修飾酶基因的傳播中起到了重要的作用[3]。不同國家和地區的研究共同顯示，住院患者痰液、尿液、咽拭子及其他不同部位分離采集的181株，及血液中分離得到的96株SM中，氨基糖苷類乙酰轉移酶基因aac (6′) -lb-cr的檢出率分別為5%和4.2%，并對復方磺胺甲噁唑、環丙沙星等抗生素也表現出不同的耐藥特性[11-12]。

2.3外排泵耐藥機制 外排泵是一類存在于細菌細胞膜起到轉運作用的蛋白質復合物。多重耐藥菌的外排泵主要可分為五大家族，即：ATP結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)、主要促進劑超家族(the major facilitator superfamily，MFS)、小多重耐藥家族(the small multidrug resistance family，SMR)、多藥和毒性復合物外排家族(the multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)和耐藥-結節-細胞分化超家族(the resistance-nodulation-cell division superfamily，RND)[13-14]。藥物進入細菌胞質后，可被上述蛋白外排泵系統排出菌體之外，從而降低藥效，導致耐藥發生。SM的主動外排泵系統是導致其耐藥的重要原因之一[15]。據已有文獻報道，該菌所攜帶的sme家族、emrCABsm、smrA和macABCsm基因，可分別編碼RND、MFS、ABC外排泵，進而能夠抵抗多種不同類別抗生素[3]。

SM sme家族基因中的smeDEF、smeIJK、smeYZ既屬于該菌的天然耐藥基因，也可通過其他外源性方式獲得。SmeDEF和SmeVWX蛋白被SM sme家族基因編碼，是該菌耐藥相關的主動外排系統。研究證實，在獲得性耐藥中，SmeDEF和SmeVWX外排泵的過表達分別與調節因子SmeT和SmeRv的突變有關[16]。smeDEF上游基因編碼的SmeT蛋白屬于TetR蛋白家族中的轉錄抑制因子，對smeDEF基因起到重要調控作用。當smeT基因表達下調或失活時，會使得smeDEF基因轉錄增加，進而導致SM產生多重耐藥。Snchez等[16]在SM外排泵過表達的研究中，對SmeT的蛋白結構作出分析：SmeT具有一些與TetR家族中的阻遏蛋白相同的結構特征，但與其他阻遏蛋白不同的是SmeT蛋白中的C端結構域，其主要參與配體結合和二聚作用，而smeT基因突變就發生在二聚作用區域。Gil-Gil等[11]在其綜述性文獻研究中指出，SM臨床分離菌株中的SmeT蛋白氨基酸位點的改變與這些菌株中SmeDEF蛋白的過表達相關，其中Thr197Pro、Leu166Gln、Arg123Lys、Leu144Pro、Arg148Gln及Ala204Glu這6個改變的氨基酸位點廣泛存在于SM多重耐藥菌株。該文獻同樣指出，SmeT是植物產生的黃酮類化合物與三氯生的靶點，兩種化學物質既能與SmeT蛋白相結合，又能誘導SmeDEF蛋白的表達[11]。除SmeDEF蛋白外，SmeABC蛋白也廣泛被證實在SM的耐藥過程中發揮關鍵作用，尤其以該菌外膜蛋白SmeC對抗生素的抵抗最為重要[3]。

2.4喹諾酮與磺胺類抗生素耐藥機制 氟喹諾酮類抗生素是一種廣譜抗菌藥，通過抑制DNA解旋酶和拓撲異構酶Ⅳ影響細菌正常功能和形態，從而改變細胞壁的多肽成分引起溶菌，以達到殺菌效果。SM編碼的DNA解旋酶和拓撲異構酶Ⅳ基因的突變是該菌對氟喹諾酮類抗生素產生耐藥的主要機制。Margaritis等[12]在其研究中證實，gyrA和 parC的基因突變提高了SM對喹諾酮類藥物的耐藥水平。影響SM對喹諾酮類藥物耐藥性的還有該菌染色體編碼的Smqnr基因，該基因屬于qnr家族，可形成具有類似雙鏈DNA結構的二聚體，保護解旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，降低喹諾酮類藥物的抑菌活性，產生低水平耐藥性[17-18]。

磺胺類藥物與細菌二氫葉酸的組成部分對氨基苯甲酸(Para-Aminobenzoic Acid,PABA)的結構類似，能與PABA競爭二氫葉酸合成酶，繼而干擾細菌對葉酸的代謝，達到抑菌目的。臨床將復方新諾明(磺胺甲噁唑/甲氧芐啶)作為SM的首選治療藥物[19]，該復方制劑能夠對葉酸的合成進行雙重阻斷，繼而抑制葉酸的合成。但近年來，也有研究報道明確指出，臨床分離SM對復方新諾明表現出明顯的耐藥特性，在幾種測試的抗生素耐藥率中排列第二位[6]。SM中的 sul和dfrA基因可以編碼二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶，使細菌恢復對葉酸的合成能力，從而抵抗磺胺類藥物[20]。sul基因有2 個亞型，分別為sul1 和sul2 基因，與插入序列共同區域連鎖，能在不同菌株之間進行傳遞。其中與I類整合素相關的sul1基因是對磺胺類藥物產生耐藥的主要基因。研究證實，sul1基因與dfrA和sul2基因相結合后能導致SM增強對復方新諾明的耐藥水平。此外，I類整合素中所攜帶的QAC基因(例如smr，qacF和qacH)能夠提高SM對復方新諾明的耐藥能力[20]。

2.5生物膜屏障 細菌菌群之間可附著在黏膜上皮細胞或無生命材料表面并與之緊密結合，在定植處形成一層膜狀結構，即細菌的生物膜。細菌生物膜的形成是一個連續動態過程，即細菌可依賴自身的鞭毛或菌毛附著在宿主細胞或無生命物體表面，通過第二信使環二鳥苷酸及分泌黏性胞外多糖物質降低細菌運動性，增加黏附能力，將菌群彼此之間緊密連接，從而穩固生物膜的形成[3,21]。生物膜在阻斷群菌與外界不利環境接觸的同時，增加了細菌的耐藥性，可通過營養限制、滲透限制等多種機制參與耐藥的形成。生物膜在形成過程中產生的黏液性物質將細菌緊密地連接在一起，內部的細菌由于營養物質缺乏，處于休眠狀態，抗生素短期治療對外部細菌具有殺傷作用，但不能有效殺滅生物膜內層的細菌[3,22]。由于生物膜具有滲透屏障作用，其形成的分子屏障和電荷屏障可以阻止抗生素的滲入。生物膜狀態下的細菌由于彼此接觸密切，在整合子、轉座子、接合性質粒、插入序列等的作用下，更易實現耐藥基因在細菌間的轉化、整合，從而發生水平轉移，產生多重耐藥[23]。

SM利用可轉移的信號因子系統rpf/DSF介導其群體感應系統(quorum sensing,QS)，QS可以通過低相對分子質量信息素在細菌間傳遞，監測周圍環境變化，調節生物膜的形成，繼而發揮對抗菌藥物的抵抗作用[15,21]。不同研究表明，在形成生物膜后，SM明顯增強對抗生素的耐藥性[18,23]。臨床治療過程中，由于中央靜脈插管、人工植入等創傷性操作，更易導致醫院內SM感染及細菌生物膜的形成，為抗生素治療SM引起的感染性疾病帶來困擾。因此，減少使用侵入性的醫療器械及合理、足量、足療程的使用抗生素可有效清除耐藥菌的感染，防范細菌生物膜相關耐藥的產生[3]。

3 SM感染的治療策略

近年來，革蘭陰性多重耐藥菌在臨床引發的感染不斷增強。SM作為其中的典型代表，耐藥機制復雜多樣，對多種抗生素產生強烈抵抗，給臨床治療該菌引起的感染性疾病帶來嚴重困難。因此，在未來的治療方案中，尋找抗菌藥物以外能夠有效遏制臨床感染性疾病的治療方法，擺脫單純依賴現有抗生素的束縛，積極研究與開展安全穩妥的治療措施，對治療多重耐藥菌引發的感染顯得格外重要。

3.1噬菌體療法 噬菌體是一類寄生在細菌、放線菌等原核細胞型微生物體內的病毒。根據是否裂解感染后的宿主菌，可將噬菌體分為溫和噬菌體和毒性噬菌體。由于噬菌體的吸附器官與細菌表面不同受體分子結構的互補性，導致其對宿主菌具有嚴格特異性和靶向性。20世紀10年代，法國巴斯德研究所科學家Herelle發現了噬菌體感染細菌這一現象。此后，Herelle分別在不同動物體內證實噬菌體能有效抑制細菌感染及降低病死率。在給予4例細菌性痢疾患者和4例淋巴腺鼠疫患者噬菌體治療后，患者癥狀逐步減輕并完全康復[24]。至此，關于將噬菌體用于治療細菌感染性疾病的研究在世界多國逐步展開。

國內、外諸多學者對SM噬菌體同樣開展了廣泛的研究。McCutcheon等[25]在其團隊的多篇文獻中報道SM噬菌體DLP1和DLP2 可將Ⅳ型菌毛作為其附著在該菌表面的初級受體。DLP4和DLP5屬感染該菌的溫和噬菌體[26-27]。文獻證實，噬菌體可通過胞溶作用機制治療SM等臨床耐藥菌導致的人體感染[28]。目前，應用噬菌體治療SM感染的基礎研究，尤其是在動物試驗方面還十分匱乏。2013年，一篇發布在浙江大學學報醫學版的文獻深入研究了噬菌體SM1治療SM感染BALB/c小鼠的過程，并通過蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色發現，當感染復數(病毒/細菌數量比)為10-4時，SM1治療組小鼠的肺、肝組織結構基本正常，且治療組小鼠全部存活。相反，對照組小鼠被SM感染后，肺組織中廣泛肺泡腔淤血，肺泡間隔毛細血管充血擴張，肝組織充血且炎細胞浸潤，48 h后全部死亡[29]。這項研究為探究噬菌體治療臨床感染效果提供了良好動物實驗依據。

此外，也有文獻指出，在未來噬菌體療法的治療方案中，可與抗生素聯合以發揮二者的協同作用[30]。筆者認為，可通過基因編輯技術將噬菌體改造，使得其以SM各不同類型外排泵系統為受體，在侵入增殖細菌引發裂解的同時，破壞抗生素外排孔道，提高菌體內藥物濃度，繼而達到清除SM感染的治療目的。但是，噬菌體療法在臨床的全面應用，仍然是一個較為漫長的過程。在保證治療安全，降低成本的同時，既要避免噬菌體可能傳播耐藥基因，同時也需注意宿主菌對噬菌體產生抵抗。

3.2中藥抗菌、新型藥物與干細胞 抗菌中藥種類豐富，成分復雜多樣。在臨床中，已廣泛用于治療細菌引起的感染性疾病。根據藥物的抗菌活性作用于不同類型的細菌，可分為抗革蘭陽性和陰性菌中藥[31]。已有多篇研究報道顯示，中藥可通過破壞細菌細胞壁和細胞膜的完整性以改變細胞通透性、影響細菌蛋白及核酸合成、抑制細菌酶活性、提高細菌對抗生素敏感性(逆轉細菌耐藥)、增強人體免疫系統功能等多個途徑發揮抗菌功效[31-34]。目前，中藥抑制SM生長的相關研究報道較少，在已知的研究結果中，西青果、黃連、黃芩對臨床分離SM菌株的抑制效果顯著，但板藍根和龍膽無抑菌活性[35]。

近年來，新型抗生素和抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)作為抗擊細菌感染的新手段受到廣泛關注。一大批抗菌譜廣泛，能夠用于治療肺炎、腹瀉、皮膚及尿路感染等多種感染性疾病的新型抗菌藥物，已進入臨床三期試驗。這些藥物既能抑制細菌合成蛋白、細胞壁、DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ和β-內酰胺酶，同時也可以擾亂細胞膜，破壞DNA和細胞[36]。AMPs是一類天然小分子多肽類物質，廣泛存在于植物、昆蟲、魚類、哺乳動物以及微生物等體內，可作為第一道防線直接殺死入侵的細菌、真菌、病毒等[37]。陽離子AMPs通常由10～50個氨基酸殘基組成，其中短鏈AMPs的長度為15～20個氨基酸，可通過其攜帶的正電荷與細菌細胞膜表面的負電荷相結合，進而破壞細菌細胞膜的完整性、抑制細菌細胞內的功能起到直接殺菌作用。此外，抗菌肽還可通過募集和活化免疫細胞，中和細菌產物對炎癥反應的抑制、增強核酸識別提高自身炎癥反應等方式調節宿主免疫功能，進而清除病原體感染[37]。

干細胞治療炎癥性疾病已在臨床研究與應用中展現出良好前景。臟器炎癥反應可謂是一把雙刃劍，當炎性因子適度產生時，可在宿主防御中發揮有效作用。一旦分泌過量，可成為致病因子加劇宿主組織損傷并導致死亡。研究指出，間充質干細胞能夠平衡過度釋放的炎性細胞因子，通過分泌趨化因子、白細胞介素及生長因子等，調節免疫細胞的招募、遷移和活化，從而達到調控受損組織炎性微環境的目的[38]。同時，間充質干細胞還具有多向分化潛能，可分化為多種臟器細胞，也可對受損組織進行修復，逆轉組織纖維化的發生。

4 結 語

SM具有多重耐藥機制，一種機制可對多種抗生素產生耐藥效應，且各機制間彼此相互聯系，相互影響。分子水平深入揭示該菌耐藥機制，有利于設計與研發針對該菌感染的抗菌藥物。SM為醫院內常見感染病原體，筆者認為在臨床治療過程中應：①合理、規范使用已有及新型抗生素，避免進一步增強SM耐藥的可能；②可選擇對SM抑菌效果顯著的多味中藥，按合適比例配藥，聯合治療該菌引發的感染；③可根據噬菌體療法、中藥、抗生素、抗菌肽、及干細胞療法的特點選擇組合，彼此配合，彼此互補。研發出一種或多種適于治療SM及其他臨床耐藥菌感染的“雞尾酒療法”。此外，對醫療器械進行有效消毒，及嚴格執行無菌操作規程可以有效降低該菌感染的發生率，以減少病原體對患者帶來的危害。