中重度阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者外周血內皮祖細胞數量和功能的變化

池偉偉，牛英豪，董麗萍，張繼華，武廣麗，宋冬梅*

(1.河北醫科大學第一醫院臨床生物樣本庫，河北 石家莊 050031；2.河北醫科大學第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，河北 石家莊 050031)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)是臨床常見的睡眠類疾病，其發病率逐年增高[1-3]。眾多研究也已證實，OSAHS是心腦血管疾病的源頭性疾病，是心血管疾病發生、發展的獨立風險因素[4-5]，對人類健康造成嚴重危害。因此，探明其疾病進程的分子機制，制定出有效治療方案是這一領域研究的重點。數量眾多的臨床證據顯示，OSAHS患者血管功能受到損傷，內皮功能如內皮依賴性血管舒張功能失調，由此可能造成OSAHS并發癥如糖尿病微血管病變及高血壓等心腦血管病變，最終引起動脈粥樣硬化形成的始動原因[6]。因此，血管內皮損傷機制是現階段OSAHS研究的主要熱點，但是，與OSAHS相關的血管內皮修復機制關注較少。最近在心血管疾病的領域的研究結果顯示，內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在可以修復損傷的血管，在修復血管的損傷的過程中具有重要意義[7-9]，EPCs是一種能直接分化為血管內皮細胞的前體細胞，在血管形成以及血管內皮損傷修復中起顯著作用，其中EPCs的數量與功能又是決定內皮再生和血管修復的關鍵因素[10-12]。因此，探明OSAHS過程中，血管內皮祖細胞數量與功能的變化，有助于進一步明確OSAHS發生、發展及其介導并發癥的發病原因，才有可能制定有效的針對性防治策略。因此，本研究通過評估OSAHS患者和正常人群EPCs的數量和增殖、遷移及黏附能力，旨在明確OSAHS患者EPCs數量和功能的變化規律，為OSAHS疾病及其導致的并發癥的預防與治療提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 前瞻性研究2016年11月—2018年7月收錄于河北醫科大學第一醫院臨床樣本庫經耳鼻咽喉科確診為OSAHS并住院治療的成人患者30例為OSAHS組，男性18例，女性12例，年齡24～67歲，平均(43.6±10.4)歲。納入標準：PSG監測每晚7 h睡眠過程中呼吸暫停和低通氣反復發作>30次或睡眠呼吸暫停低通氣指數(apnea hypopnea index,AHI)≥5次/h者，且呼吸暫停和低通氣以阻塞性為主，參考依據《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(2011年修訂版)》[13]具體標準進行。排除標準：①就診前或住院期間發現患有慢性阻塞性肺疾病、肺動脈高壓、支氣管哮喘等肺部疾病者；② 3個月內有心絞痛、心肌梗死發作病史者；③ 就診時患有嚴重中樞性疾病及精神疾病者；④ 患有甲狀腺功能減退癥、慢性腎功能衰竭者；⑤ 就診前或住院期間發現患有惡性腫瘤疾病或自身免疫性疾病者；⑥ 患有胸廓畸形或神經肌肉性疾病者；⑦ 近期曾服用或正在服用影響睡眠呼吸類藥物者；⑧ 近期患有上呼吸道感染者；⑨ 既往急慢性肝炎或其他肝臟疾病者；⑩全身性激素替代療法史或肢端肥大癥者。同時選取河北醫科大學第一醫院進行體檢的人員中選擇年齡匹配的、自愿接受免費的多導睡眠監測(polysomnography,PSG)檢查后排除OSAHS者30例為對照組，男性16例，女性14例，年齡28～65歲，平均(42.8±11.2)歲。2組性別、年齡等一般資料無統計學意義(P>0.05)。具有可比性。

本研究經醫院倫理委員會通過，入組人員均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1外周血內皮祖細胞的分離、鑒定與培養 無菌采集參與者(空腹12 h，靜坐10 min)新鮮靜脈全血10 mL至肝素抗凝 (10 U/mL) 離心管。密度梯度離心法收集單核細胞，接種至預先包被人纖維連接蛋白的24孔細胞培養板，內皮細胞生長培養基(endothelial cell growth medium-2,EGM-2)培養4 d，非貼壁細胞予以磷酸鹽緩沖液除去，培養液更換至1周。收集細胞，在其中加入acLDL-Dil和FITC-UEA-1抗體，常溫孵育1 h，染色，完成后用熒光顯微鏡拍照，acLDL-Dil及FITC-UEA-1雙標記者為EPCs。

1.2.2測定2組人群EPCs的數量 采用菌落形成法，使用濃度為20 mg/L人纖維連接蛋白預孵育六孔板，調整單核細胞的密度為5×109個進行接種，繼續孵育2 d后收集非黏附細胞，調整密度為1×109細胞/孔，接種至鋪有人纖維連接蛋白的24孔板中，連續培養5 d，觀察集落形成并計數，評價兩組EPCs的數量。

1.2.3測定2組EPCs的增殖能力 貼壁細胞收集消化，用人纖維連接蛋白包被24孔細胞培養板，接種相同數目的內皮祖細胞，每個標本設置3個空白對照復孔，在5% CO2、37 ℃下培養24 h，將20 μL二苯基四氮唑溴鹽(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)液體加入每孔內，培養4 h，去除上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，混勻，在490 nm波長的酶標儀下檢測吸光度，評價2組EPCs的增殖能力。

1.2.4測定2組EPCs的遷移能力 貼壁細胞收集消化，Boyden小室的下室加入EGM-2培養基，向上室注入2×105個內皮祖細胞，在5%二氧化碳溫箱內、37 ℃培養24 h；將濾膜上的未移動細胞刮去，甲醇固定，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色10 min，顯微鏡下觀察向低層遷移的細胞，評價2組EPCs的遷移能力。

1.2.5測定2組EPCs的黏附能力 貼壁細胞收集消化，用人纖維連接蛋白包被24孔細胞培養板，接種相同數目的內皮祖細胞，在5% CO2、37 ℃下培養0.5 h，用PBS洗去未貼壁的細胞，評價兩組EPCs的黏附能力。

1.3統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件處理數據。計量資料比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1臨床資料比較 OSAHS組BMI為(28.400±4.857)，明顯高于對照組(25.100±3.650)，差異有統計學意義(t=2.587，P<0.05)；OSAHS組AHI為(35.900±11.015)，明顯高于對照組(2.600±1.016)，差異有統計學意義(t=13.440，P<0.01)。

2.2OSAHS患者外周血EPCs數量評估 OSAHS組外周血EPCs數量為(23.490±5.69)個，明顯低于對照組(33.150±9.85)個，差異有統計學意義(t=4.395，P<0.01)，見圖1。

圖1 2組人群外周血內皮祖細胞數量結果

2.3OSAHS患者外周血EPCs增殖能力評估 OSAHS組吸光度為(0.350±0.019)，明顯低于對照組(0.920±0.038)，差異有統計學意義(t=70.260，P<0.01)。

2.4OSAHS患者外周血EPCs遷移能力評估 OSAHS組外周血EPCs遷移數為(14.590±7.256)個，明顯低于對照組(26.460±5.987)個，差異有統計學意義(t=6.063，P<0.01)。

2.5OSAHS患者外周血EPCs黏附能力評估 OSAHS組外周血EPCs黏附率為(17.680±4.397)%，明顯低于對照組(23.280±3.857)%，差異有統計學意義(t=30.790，P<0.01)。

3 討 論

EPCs是一種前體細胞，可以直接分化形成血管內皮細胞，它的作用涉及血管形成、血管內皮損傷、血管內皮修復等方面，具有重要顯著作用。當前的研究表明EPCs作用機制有兩個方面，一在促進新心血管形成方面：通過EPCs本身的分化、增殖而形成新生血管，從而無需本來的血管系統為依靠；二在內皮細胞修復方面：EPCs本身可以通過旁分泌效應分泌血管內皮生長因子等細胞生長因子，從而促進局部血管內皮細胞增殖。在心腦血管疾病的研究中已經發現高血壓、高血脂、高血糖以及相關血流動力學改變可降低骨髓活化進入外周血EPCs的數量，并使EPCs修復功能下降，同時還可導致EPCs早衰和凋亡[14-17]，使其無法對有功能缺陷的內皮細胞進行及時修復，這是內皮功能受損后無法及時修復的主要原因；同時研究人員發現這些骨髓來源的EPCs通過骨髓動員、歸巢，在損傷部位分化為成熟的血管內皮細胞并分泌促進血管生成的相關因子，對心肌梗死以及缺血性休克具有潛在的治療效果[18-19]，因此EPCs在血管內皮損傷及修復中的地位和作用也日益得到了廣泛的關注。

在OSAHS研究領域，盡管已知OSAHS患者的血管內皮功能受損可能是導致動脈粥樣硬化形成的起始誘因[5]，但是涉及OSAHS相關血管內皮修復問題，尤其是EPCS介導的內皮修復問題的研究較少；OSAHS患者EPCs數量、功能的變化規律還不清晰、研究尚處于初始階段，初步臨床研究結果也存在不一致之處，例如Jelic 等[20]研究顯示，無心腦血管相關疾病的成年OSAS患者其外周血EPCs數量減低，血流介導的血管舒張功能下降，但是也有報道并不認同這一結論，Carreras 等[21]研究發現，大鼠OSAS動物模型中外周血間充質干細胞的數目明顯增多，為了明確EPCs數量和功能在OSAHS患者體內的變化規律，本研究評估了正常對照組和OSAHS患者2組人群EPCs數量和功能，結果顯示，OSAHS患者體內EPCs的數量明顯低于健康對照組，與Jelic等[20]研究結果相符；OSAHS患者體內EPCs數量減少的原因，可能是OSAHS患者體內的慢性間斷性缺氧狀態，影響了PI3K/AKT/eNOS等EPCs相關信號通路，導致EPCs功能障礙繼而造成了EPCS的數量減少。同時，EPCs可以定向分化為內皮細胞，從而達到修復血管內皮損傷的目的，是保持血管完整性的最重要的機制之一。然而，當血液中EPCs的數量減少時會影響其修復功能。外周血EPCs的增殖能力、黏附能力、遷移能力決定其是否可到達受損部位，本研究的結果顯示，OSAHS患者體內EPCs的增殖細胞數、遷移細胞數及黏附細胞數較對照組均降低，提示OSAHS患者血管修復能力已受到損傷。

綜上所述，OSAHS可以導致外周血中EPCs數量減少并使其增殖能力、黏附能力及遷移能力受到損傷，繼而影響血管內皮的功能，這可能是OSAHS引起動脈粥樣硬化血管疾病發生發展的重要途徑。除直接損傷血管外，影響血管內皮修復機制，減弱EPCs的數量、減退內皮祖細胞功能，可能也是OSAHS而導致血管內皮功能障礙的原因。