初治彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者h(yuǎn)sa-miR-23a、hsa-miR-566表達(dá)水平及其臨床意義

陶盛能，張旭晗，張 睿，朱小玉，王小華

(1.安徽省蕪湖市第二人民醫(yī)院血液內(nèi)科，安徽 蕪湖 241000；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，安徽 合肥 230000；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，安徽 合肥 230000)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)在我國(guó)發(fā)病率占非霍奇金淋巴瘤患者的30%～40%[1-2]。該疾病無(wú)論是在組織形態(tài)學(xué)、臨床表現(xiàn)，還是預(yù)后均具有顯著的特異性。近年來(lái)DLBCL病理亞型及生物治療的相關(guān)科研均取得一定的進(jìn)展，但仍有部分患者在接受DLBCL的一線藥物(如妥昔單抗、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、潑尼松龍、環(huán)磷酰胺)治療后的效果較差，且很快出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致部分患者預(yù)后不佳[3-4]。在腫瘤miRNAs表達(dá)譜中，有研究證實(shí)hsa-miR-23a-3p可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞復(fù)制增加并增加耐藥癌基因的表達(dá)[5]；在腎細(xì)胞癌中miR-566低表達(dá)患者生存期更長(zhǎng)[6]。然而，關(guān)于外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平與DLBCL患者臨床特征及預(yù)后生存期的關(guān)系研究尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究通過(guò)探究DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平及其臨床意義，旨以DLBCL的診治及預(yù)后研判提供一種新思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年5月—2019年1月安徽省蕪湖市第二人民醫(yī)院收治的DLBCL患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整，年齡>18歲；②符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)2013年制訂的DLBCL診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；③在取標(biāo)本時(shí)，患者尚未經(jīng)過(guò)任何治療；④患者均接受足夠療程的R-CHOP(R為利妥昔單克隆抗體，C為環(huán)磷酰胺，H為阿霉素，O為長(zhǎng)春新堿，P為潑尼松)化療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、腦、肺、肝、腎等器官功能嚴(yán)重?fù)p害者；②有長(zhǎng)期進(jìn)行激素藥物治療史者；③對(duì)化療藥物過(guò)敏者；④中途失訪或轉(zhuǎn)院治療者。符合上述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的患者共60例，并將其納入觀察組，男性36例，女性24例，年齡18～72歲，平均(55.78±8.93)歲。根據(jù)參照匹對(duì)原則，選取60例體檢健康者作為對(duì)照組，男性35例，女性25例，年齡18～71歲，平均(54.24±8.75)歲。觀察組與對(duì)照組的性別、年齡等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566指標(biāo)檢測(cè) 于治療前抽取DLBCL患者空腹靜脈血5 mL，同時(shí)收集健康者體檢時(shí)的靜脈血，3 000 r/min離心10 min后，分離血清,收集上層清液進(jìn)行檢測(cè)。采用賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司的miRNA Vana PARIS試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)對(duì)血清的總RNA進(jìn)行提取。采用賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司的TaqMan miRNA試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。hsa-miR-23a-3p上游引物：5′-ATCCAGTAA-GGACTG-3′； hsa-miR-23a-3p下游引物：5′-CGAATCAGGACTCGTC-3′； hsa-miR-566上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATG-3′； hsa-miR-566下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′。完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用熒光定量PCR法檢測(cè)，以U6為內(nèi)參，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min)延伸72 ℃(7 min)。每個(gè)標(biāo)本均重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)公式2-△△CT計(jì)算hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2預(yù)后隨訪 對(duì)60 例DLBCL患者出院后通過(guò)電話、門診等多方式進(jìn)行隨訪。預(yù)后定義，起點(diǎn)時(shí)間：DLBCL患者開(kāi)始治療的時(shí)間；終點(diǎn)事件：包括DLBCL病情進(jìn)展、死亡，或隨訪期間內(nèi)出現(xiàn)失訪者；終點(diǎn)時(shí)間：存活，且能隨訪到的患者，以2019年11月30日為隨訪截止時(shí)間，失訪者以最后1次隨訪時(shí)間為終點(diǎn)時(shí)間，生存時(shí)間為終點(diǎn)時(shí)間減去起點(diǎn)時(shí)間。

1.3觀察指標(biāo) ①觀察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566在初治DLBCL患者與健康人群的差異。②觀察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566與DLBCL患者臨床特征[性別、年齡、腫瘤分期、淋巴結(jié)區(qū)受累數(shù)、國(guó)際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index，IPI)、血清乳酸脫氫酶濃度(lactic dehydrogenase，LDH)]的關(guān)系。③觀察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平對(duì)DLBCL患者生存時(shí)間的影響。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用 Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1觀察組與對(duì)照組的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平比較 觀察組患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 觀察組與對(duì)照組的hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of expression levels of hsa-miR-23a-3p and hsa-miR-566 between the observation group and the control group

2.2外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平與DLBCL患者臨床特征的關(guān)系 DLBCL患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平在不同年齡、性別、LDH指標(biāo)組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，在不同腫瘤分型、淋巴結(jié)區(qū)受累數(shù)、IPI積分中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平與DLBCL患者的臨床特征關(guān)系Table 2 The relationship between the expression levels of hsa-miR-23a-3p and hsa-miR-566 in peripheral blood and the clinical characteristics of DLBCL patients

2.3外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平對(duì)DLBCL患者生存時(shí)間的影響 至隨訪截止時(shí)間，60例DLBCL患者的隨訪時(shí)間為9～60個(gè)月，平均中位隨訪時(shí)間29.82個(gè)月，死亡28例，無(wú)病例失訪。分別以患者外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達(dá)水平均數(shù)3.35、1.69作為分割臨界值，將患者分為hsa-miR-23a-3p高表達(dá)組(32例)、hsa-miR-23a-3p低表達(dá)組(28例)；hsa-miR-566高表達(dá)組(29例)、hsa-miR-566低表達(dá)組(31例)。其中hsa-miR-23a-3p高表達(dá)組3年總生存率為40.63%(13/32)，明顯低于低表達(dá)組的67.86%(19/28)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.450，P=0.035)；hsa-miR-23a-3p高表達(dá)組、hsa-miR-23a-3p低表達(dá)組的中位生存時(shí)間分別為26.73個(gè)月和32.52個(gè)月(P<0.001)，見(jiàn)圖1。hsa-miR-566高表達(dá)組3年總生存率為37.93%(11/29)，明顯低于低表達(dá)組67.74%(21/31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.350，P=0.021)；hsa-miR-566高表達(dá)組、hsa-miR-566低表達(dá)組的中位生存時(shí)間分別為27.45個(gè)月和32.35個(gè)月(P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖1 DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p高表達(dá)與低表達(dá)的生存曲線

圖2 DLBCL患者外周血hsa-miR-566高表達(dá)與低表達(dá)的生存曲線

3 討 論

DLBCL是一類形態(tài)學(xué)、免疫分型及分子機(jī)制極為復(fù)雜的惡性淋巴瘤，導(dǎo)致目前臨床科研對(duì)DLBCL具體分型標(biāo)志、發(fā)生機(jī)制及早期標(biāo)志物的尋找仍存在較大盲區(qū)[8-9]。致使部分DLCBL患者的治療療效仍較差，且部分患者極易出現(xiàn)耐藥情況[10]，進(jìn)而影響患者的生存期。導(dǎo)致這一因素可能與腫瘤細(xì)胞自我更新能力增強(qiáng)有關(guān)。而腫瘤細(xì)胞更新能力、凋亡受阻、分化能力障礙而致細(xì)胞停滯于發(fā)育的不同階段均涉及多種癌基因、抑癌基因及復(fù)雜的信號(hào)通路。因此，尋找與DLBCL相關(guān)基因標(biāo)志物已成為臨床科研的重點(diǎn)。

以高度保守型的內(nèi)源性非編碼微小分子RNA(microRNA，miRNA)廣泛涉及到生命的重要過(guò)程，如細(xì)胞增殖、代謝、遷移、分化等[11]。正常表達(dá)的miRNA 能夠調(diào)控細(xì)胞分化、增殖，但異常表達(dá)則可促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[12]。目前至少約有30個(gè)miRNA已被發(fā)現(xiàn)與DLBCL 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p表達(dá)水平均高于健康人群，且與DLBCL患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)區(qū)受累數(shù)及IPI指數(shù)存在顯著相關(guān)。提示外周血hsa-miR-23a-3p表達(dá)水平可能參與DLBCL發(fā)生發(fā)展。hsa-miR-23a-3p屬于miR-23的亞型，參與細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段，在結(jié)腸癌、肺癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)，屬于致癌基因。高表達(dá)的miR-hsa-23a可作為RUNX2靶點(diǎn)通過(guò)挽救受損細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)揮致癌基因的作用[14]。RUNX2恰好是致癌轉(zhuǎn)錄因子RUNX家族成員，在癌變的發(fā)展過(guò)程中，可幫助受損的癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[15]。因此hsa-miR-23a-3p表達(dá)上調(diào)還可反映腫瘤分期、淋巴結(jié)區(qū)受累情況。本研究還發(fā)現(xiàn)DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p高表達(dá)組的3年總生存率、中位生存時(shí)間均低于低表達(dá)患者。這與Wang等[16]研究提到的hsa-miR-23a-3p高表達(dá)是DLBCL預(yù)后不良標(biāo)志物的結(jié)論完全相符。因?yàn)閔sa-miR-23a-3p表達(dá)上調(diào)不僅可通過(guò)靶向性抑制作用，發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，加快其侵襲進(jìn)程的作用。還可抑制編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移抑制因子1[17]，促使腫瘤細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響患者預(yù)后。

抑制血管新生成一直被臨床認(rèn)為是治療腫瘤的主要方向。在基因信息學(xué)預(yù)測(cè)提示中，VHL基因是hsa-miR-566的調(diào)控靶點(diǎn)，VHL(Von Hippel-Lindau)基因定位于 3p25～26 區(qū)，是一種重要的腫瘤抑制基因。hsa-miR-566表達(dá)上調(diào)可通過(guò)作用于VH基因L，從而影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，而VEGF的表達(dá)水平被認(rèn)為在DLBCL 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。因?yàn)閂EGF可通過(guò)旁分泌在DLBCL中發(fā)揮生物學(xué)作用，如刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞促使其增殖形成新生血管[19]，提高癌細(xì)胞增殖活性，體現(xiàn)出癌變及惡性度的變化，從而影響患者預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)DLBCL患者外周血hsa-miR-566高于健康人群，且與DLBCL患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)區(qū)受累數(shù)及IPI指數(shù)存在顯著相關(guān)。說(shuō)明外周血hsa-miR-566不僅參與DLBCL發(fā)生過(guò)程，可能還通過(guò)分子多層級(jí)聯(lián)介導(dǎo)DLBCL患者預(yù)后。在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，hsa-miR-566表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)VHL的表達(dá)[20]，而VHL是腫瘤抑制基因，其表達(dá)上調(diào)有利于患者病情轉(zhuǎn)歸。相反，當(dāng)hsa-miR-566表達(dá)上調(diào)時(shí)，則不能很好的促進(jìn)VHL表達(dá)，致使這種腫瘤抑制基因功能消弱，從而影響患者預(yù)后。孫鶴立等[21]研究也提到hsa-miR-566上調(diào)可能使DLBCL患者產(chǎn)生較差結(jié)局。本研究也發(fā)現(xiàn)DLBCL患者外周血hsa-miR-566高表達(dá)組的3年總生存率、中位生存時(shí)間均低于低表達(dá)患者，與上述結(jié)論相符。但目前關(guān)于hsa-miR-566表達(dá)水平與不同腫瘤的相關(guān)研究較少，其在DLBCL中的具體作用機(jī)制是通過(guò)何種通路調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，尚有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，初治DLBCL患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566均呈高表達(dá)，且與臨床分期、淋巴結(jié)區(qū)受累數(shù)、IPI指數(shù)及生存期存在密切聯(lián)系。兩項(xiàng)指標(biāo)有望成為診斷DLBCL的重要標(biāo)記物。