干擾素對ET和PV的JAK2V617F基因突變負荷和IL-8的表達的影響

黃繼賢 潘成云 廖建軍 謝治軍 肖捷 肖健

【摘要】 目的 探討干擾素治療原發性血小板增多癥（ET）和真性紅細胞增多癥（PV）患者的效果及對JAK2V617F基因突變負荷和白細胞介素-8（IL-8）表達的影響。方法 30例JAK2V617F基因突變陽性ET患者（19例）和PV患者（11例）， 采用干擾素α-2b治療。觀察治療6個月后的臨床指標， 比較治療前后JAK2V617F基因突變負荷和IL-8的表達水平變化情況， 統計治療后血液學療效。結果 干擾素治療6個月后， ET+PV患者的血液學總緩解率達86.67%， 其中完全血液學緩解（CHR）和部分血液學緩解（PHR）分別為70.00%和16.67%。ET和PV患者的血液學總緩解率、CHR、PHR分別為100.00%和63.64%、78.95%和54.55%、21.05%和9.09%。ET+PV、ET、PV患者干擾素治療6個月后JAK2V617F基因突變負荷分別為（28.25±12.99）、（25.84±10.72）、（32.42±15.87）%， 均低于治療前的（44.50±23.90）、（34.48±15.02）、（67.00±19.26）%， 差異均有統計學意義（P<0.05）。ET+PV、ET、PV患者干擾素治療6個月后IL-8表達水平與治療前比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。結論 干擾素治療ET和PV患者6個月， 能明顯降低JAK2V617F基因突變負荷， 使大部分患者達到血液學緩解， 但并未能明顯降低IL-8水平。

【關鍵詞】 干擾素;原發性血小板增多癥;真性紅細胞增多癥;JAK2V617F基因突變;白細胞介素-8

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.24.001

【Abstract】 Objective? ?To discuss the effect of interferon on essential thrombocythemia （ET）? and polycythemia vera （PV） as well as its effect on the JAK2V617F gene mutation load and expression of interleukin 8 （IL-8）. Methods? ?30 patients with JAK2V617F gene mutation positive ET （19 cases） and PV （11 cases） were treated with interferon α-2b. The clinical indicators of 6 months after treatment were observed. JAK2V617F gene mutation load and IL-8 expression level changes before and after treatment was compared， and the hematological efficacy was analyzed. Results? ?After 6 months of interferon treatment， the total hematological remission rate of ET + PV patients was 86.67%， in which complete hematological remission （CHR） and partial hematological remission （PHR） were 70.00% and 16.67% respectively. The total remission rate， CHR and PHR of ET and PV patients were 100.00% and 63.64%， 78.95% and 54.55%， 21.05% and 9.09% respectively. After 6 months of interferon treatment， JAK2V617F gene mutation load of ET+PV， ET and PV patients were （28.25±12.99）， （25.84±10.72） and （32.42 ± 15.87）% respectively， which was lower than that before treatment （44.50±23.90）， （34.48±15.02） and （67.00±19.26%）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. After 6 months of interferon treatment， IL-8 level of ET+PV， ET and PV patients had no statistically significant difference compared with that before treatment （P>0.05）. Conclusion? ?6 months?of interferon treatment in ET and PV patients can significantly reduce the JAK2 V617F gene mutation load to hematologic response in most patients; however， it does not significantly reduce the level of IL-8.

【Key words】 Interferon; Essential thrombocythemia; Polycythemia vera; JAK2V617F gene mutation; Interleukin-8

Ph染色體陰性的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative?neoplasms， MPN）也常被稱為經典型MPN， 以驅動基因激活JAK/STAT通路導致骨髓細胞持續克隆增殖， 且伴有多種細胞因子異常為特征的一組異質性造血干細胞疾病[1， 2]， 包括原發性ET、PV和原發性骨髓纖維化（PMF）。雖然羥基脲和干擾素作為治療MPN的常用藥物在臨床工作中已使用多年， 且迄今為止沒有令人信服的證據證明羥基脲致白血病作用[3]， 但是一項中位隨訪達16.3年的隨機研究顯示[4]， 羥基脲治療患者20年累計白血病發生率達22%。干擾素雖然需要反復皮下注射， 不如口服羥基脲方便使用， 但仍然有不少患者因其未致白血病效應而選用。為探討MPN患者干擾素治療前后IL-8和驅動基因負荷的變化情況， 本文總結和分析了近4年以來本院使用干擾素治療MPN的情況， 現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2016年10月～2019年8月就診于本院接受干擾素治療的30例JAK2V617F基因突變陽性的ET患者（19例）和PV患者（11例）。診斷均符合2016年WHO公布的MPN診斷標準[5]。

1. 2 方法 對所有患者進行干擾素治療， 方法為：干擾素α-2b皮下注射， 每隔1日1次， 300 μg/次， 達到CHR后， 在維持治療過程中如能持續緩解， 則干擾素則減量為1～2次/周， 300 μg/次。ET患者早期治療均加用羥基脲0.5～1.0 g/d， 待達到CHR后逐漸減量和停用。而PV患者， 治療過程中使用血細胞分離機祛除紅細胞， 使紅細胞壓積（HCT）低于45%（男性）或42%（女性）。整個治療過程中， 所有ET和PV患者如果無阿司匹林禁忌證， 則同時口服阿司匹林腸溶片， 100 mg/d。治療6個月。

1. 3 觀察指標及判定標準

1. 3. 1 觀察患者臨床特征 包括性別、年齡、白細胞、血紅蛋白、血小板、脾大、JAK2V617F基因突變負荷。

1. 3. 2 檢測JAK2V617F基因突變負荷[6] 留取標本檢測的時間點為初診時、干擾素治療后6個月。方法如下：留取外周血或骨髓標本提取DNA后， 通過聚合酶鏈反應（PCR）采用TaqMan探針法檢測JAK2野生型基因和JAK2V617F基因突變的表達水平。JAK2V617F基因突變負荷的計算方法為：JAK2V617F基因突變負荷=JAK2V617F突變拷貝數/（JAK2V617F突變拷貝數+JAK2V617F野生型拷貝數）。

1. 3. 3 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測IL-8 留取標本檢測的時間點為初診時、干擾素治療后6個月。方法如下[7]：留取患者外周血血清標本后， 酶標板設置待測樣品孔、標準品孔和空白顯色孔， 先后加IL-8抗體、親和素-過氧化物酶復合物、顯色液和終止液反應， 酶標儀測定各孔光密度（OD）值， 與標準品稀釋后測定的標準曲線比對， 計算每孔IL-8的濃度。

1. 3. 4 比較干擾素治療后血液學療效 療效判定標準：①PV的療效判定標準[8]：CHR的定義為在無放血治療的情況下男性HCT<45%， 女性HCT<42%;不伴脾大， 白細胞（WBC）<10×109/L， 血小板（PLT）<400×109/L。PHR的定義為男性HCT<45%， 女性HCT<42%;伴脾大， 或 PLT>400×109/L， 或放血頻率減少50%以上。②ET的療效判定標準[9]：CHR的定義為在未合用羥基脲和阿那格雷治療的情況下， PLT≤400×109/L且無血栓和出血事件。PHR的定義為 PLT下降50%以上， 但仍>400×109/L， 且無血栓和出血事件。

1. 3. 5 觀察干擾素治療后不良事件發生情況。

1. 4 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗;不服從正態分布的計量資料以[M（P25， P75）]表示， 采用秩和檢驗;P<0.05表示差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 7.0繪制柱狀圖。

2 結果

2. 1 30例患者臨床特征 30例JAK2V617F基因突變陽性的ET和PV患者接受干擾素α-2b治療6個月以上， 男性12例， 女性18例。其中ET患者19例（男9例， 女10例）， PV患者11例（男3例， 女8例）。見表1。

2. 2 治療6個月后血液學療效比較 干擾素治療6個月后， ET+PV患者的血液學總緩解率為86.67%（26/30）， 其中70.00%（21/30）達CHR， 16.67%（5/30）達PHR。ET患者的血液學總緩解率為100.00%（19/19）， 其中78.95%（15/19）達CHR， 21.05%（4/19）達PHR;而PV患者的血液學總緩解率為63.64%（7/11）， 其中54.55%（6/11）達CHR， 9.09%（1/11）達PHR。見圖1。

2. 3 治療前后JAK2V617F基因突變負荷變化比較

ET+PV、ET、PV患者干擾素治療6個月后JAK2V617F基因突變負荷分別為（28.25±12.99）%、（25.84±10.72）%、（32.42±15.87）%， 均低于治療前的（44.50±23.90）%、（34.48±15.02）%、（67.00±19.26%）， 差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2. 4 治療前后IL-8的表達水平比較 ET+PV、ET、PV患者干擾素治療6個月后IL-8表達水平與治療前比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2. 5 干擾素治療后不良事件發生情況 本研究接受干擾素治療的患者， 出現的不良事件均為1～2級， 無3～4級不良事件。首次使用干擾素后出現22例以畏寒、發熱、骨痛為主要臨床表現的流感樣癥狀， 均出現于治療早期;第2～4次后癥狀明顯減輕和消失。此外， 3例出現脫發， 1例出現食欲減退。

3 討論

驅動基因突變和細胞因子異常與Ph染色體陰性MPN的發病機制有關。表型驅動基因突變致使細胞信號通路（JAK-STAT）的激活， 繼而導致骨髓造血干細胞的過度增殖， 是MPN發病機制的關鍵[10， 11]。此外， 有研究發現， MPN患者中IL-8、血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）等眾多細胞因子表達水平較健康人群存在明顯差異[12]， 與發病機制有關， 且可能是潛在的治療靶點[13]。因此， 減少和消除驅動基因突變負荷和異常細胞因子成為探討治療MPN的重要研究方向。

MPN的表型驅動基因包括JAK2、CALR、MPL。JAK2基因突變中以JAK2V617F基因突變最常見。且JAK2V617F突變也是MPN中最常見的驅動基因突變， 其在PV、ET和PMF中的檢出率分別為95%、50%～75%和40%～75%[11]。通過治療減少MPN驅動基因突變負荷， 是目前一種有效且可行的方法。MPN的驅動基因與疾病的臨床表型和預后有關[14]。有研究認為， 較重的JAK2V617F基因突變的腫瘤負荷可能與MPN進展為MF有關[14， 15]。長效干擾素可降低JAK2V617F和CALR基因突變的基因負荷[16， 17]， 并達到持續的CHR[3， 18]。

國內外研究顯示， 長效干擾素治療MPN的療效確切， 但結果差異較大。Masarova等[19]對40例ET（19例JAK2V617F基因突變陽性）和43例PV（41例為JAK2V617F基因突變陽性）患者使用長效干擾素（PEG-IFN-α-2a）治療， 中位隨訪83個月， 血液學總緩解率為80%， 中位血液學緩解時間為66個月。該研究中有63%的患者在長效干擾素治療后JAK2V617F基因突變負荷下降， 均表現為開始治療后迅速下降， ET和PV患者分別在治療后1年和2年達到平臺期。患者能否達到血液學緩解和達到緩解時間與年齡、性別、基線臨床特征、脾腫大、驅動基因類型及JAK2V617F基因突變負荷無關。Kiladjian等[8]對37例PV（29例JAK2V617F基因突變陽性）患者使用長效干擾素（PEG-IFN-α-2a）治療12個月后全部達到血液學緩解， 其中35例（94.6%）為CHR， 2例（5.4%）為PHR。龐纓等[20]對73例MPN患者（ET 46例， PV27例）使用干擾素α治療， 治療12個月后ET和PV患者的血液學總緩解率分別為65.1%和85.1%， CHR分別為25.9%和59.3%， PHR分別為39.1%和26.1%。該研究未進行JAK2V617F基因突變負荷檢測， 但定性檢查發現， 干擾素α治療1～3年的患者， ET和患者JAK2V617F基因突變的轉陰率分別為41%和56%。本研究發現， ET+PV、ET和PV患者使用干擾素治療6個月后， 血液學總緩解率分別為86.67%、100%和63.64%， 其中CHR分別為70.00%、78.95%和54.55%， PHR分別為16.67%、21.05%和9.09%， 且發現ET和PV患者的JAK2V617F基因突變負荷較治療前明顯下降， 差異有統計學意義（P<0.05）。

能否減少和消除MPN患者的異常細胞因子， 一直是學界探討的話題之一。Tefferi等[21]對127例PMF患者的外周血檢測后發現， IL-8、白介素介素-6（IL-6）、INF-α等19種細胞因子明顯高于正常人， 升高的IL-8與體質癥狀和生存時間縮短相關， 并可預測無白血病進展的生存率。Vaidya等[22]對 65例PV患者檢測外周血后發現IL-8、IL-6、IFN-γ等16種細胞因子較正常人異常升高。本文前期研究[7]對123例MPN患者（ET 63例、PV 28例、PMF 33例）檢測外周血后也發現IL-8明顯較正常人明顯升高。PMF的發病假說[23]認為， 大量異常因子存在的炎性環境， 促使正常細胞轉化為惡性細胞并克隆增殖， 繼而導致MPN的發生和進展。因此， 改善MPN患者在異常的炎性環境日益受到血液學界的重視。蘆可替尼能降低JAK2V617F基因突變負荷和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6等細胞因子的發現[24]， 使作者猜想干擾素是否能有類似的作用。在本研究中， 雖然ET+PV患者經干擾素治療6個月后， IL-8表達水平低于治療前， 但差異無統計學意義（P>0.05）， 仍未能提示干擾素能明顯減低IL-8的表達。IL-8與干擾素治療時間相對較短， 還是IL-8與干擾素治療無相關性， 仍需進一步研究探討。

綜上所述， 干擾素治療ET和PV患者6個月， 能明顯降低JAK2V617F基因突變負荷， 使大部分患者達到血液學緩解， 但并未能明顯降低IL-8水平。

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[收稿日期：2020-05-22]