三硝基甲苯分子印跡電化學傳感器的制備和應用

王成，郭建良，饒國寧

（南京理工大學化工學院，江蘇南京210094）

三硝基甲苯（TNT）是一種常見的單體炸藥，性質穩定、爆炸威力大，廣泛應用于彈藥合成和裝藥工業，同時也常被不法分子利用，造成恐怖襲擊，嚴重威脅著社會穩定和財產安全[1]，因此需要采取有效的爆炸物檢測技術。當前，常用的爆炸物識別和探測技術分為微痕量探測技術和體探測技術，包括離子遷移光譜、激光拉曼光譜以及X 射線成像技術等，然而這些技術均存在不足[2]。分子印跡技術在爆炸物檢測方面有著獨特的優勢。分子印跡技術是以目標分子為模板，制備對目標分子有特異選擇性的聚合物[3]，即分子印跡聚合物（MIPs）。MIPs 具有與目標分子在空間結構和功能基團上完全匹配的空穴[4]，對目標分子能夠進行特異性識別，其制備簡單、結構穩定且可重復利用。

傳感器是指通過轉化器與敏感部件的配合,對特定物質具有良好選擇性和可逆響應的分析裝置。MIPs 可以用作傳感器的識別元件，得到分子印跡傳感器。分子印跡電化學傳感器是基于分子印跡技術和電化學檢測技術[5]，利用MIPs作為電極的敏感材料[6]，用來構建電化學傳感器，其對模板分子具有高選擇性的特異性識別性能，具備穩定性好、靈敏度高、制備和檢測成本低等優點。

目前制作該傳感器的方法分為兩種，即直接聚合或間接涂滴。直接聚合是指在轉換器的表面直接進行MIPs 的合成，從而在表面得到分子印跡薄膜[7]（如電化學聚合）；間接涂滴是指通過實驗先得到MIPs，再將其涂滴到轉換器表面[8]（如表面涂覆法）。本文先通過分子印跡技術制得TNT 的分子印跡聚合物，然后通過表面涂覆法在玻碳電極表面形成TNT 分子印跡聚合膜，制備出電化學傳感器，并通過循環伏安法和差分脈沖伏安法對修飾電極的電化學行為進行考察。分子印跡技術與電化學傳感器的聯用有望給TNT 的檢測開辟新路徑。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

三硝基甲苯，軍用品；2,4-二硝基甲苯（DNT），CP，國藥集團化學試劑有限公司；環三次甲基三硝胺（RDX），軍用品；過硫酸鉀（KPS），AR，阿拉丁試劑有限公司（中國上海）；十二烷基苯磺酸鈉（SDBS），AR，邁瑞爾化學技術有限公司；甲基丙烯酸（MAA），AR，國藥集團化學試劑有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA），AR，阿拉丁試劑有限公司（中國上海）；其余試劑均為分析純，實驗所用水均為蒸餾水。

集熱式磁力加熱攪拌器（DF-1），鞏義予華儀器；紫外-可見分光光度計（UV,Evolution 220），美國賽默飛世爾；掃描電子顯微鏡（SEM,XL-30 ESEM），美國FEI；傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR, Nicolet IS10），美國賽默飛世爾；高效液相色譜分析儀（HPLC,1200），美國安捷倫；臺式高速離心機（TG16-WS），湖南湘儀；真空干燥箱（DZF6050），上海精宏；數控超聲波清洗器（KQ-250B），昆山超聲儀器；電化學工作站（CHI660D），上海辰華儀器。

1.2 TNT分子印跡聚合物微球的制備

采用乳液聚合法制備TNT 的分子印跡聚合物。在100mL水溶液中加入12mg SDBS，攪拌混合均勻加入250mL 燒瓶；在30mL 乙腈溶液中加入227.2mg模板分子TNT、344.36mg功能單體MAA和1.982g 交聯劑EDGMA，將混合溶液超聲5min 形成均勻溶液，倒入250mL 燒瓶中。充分攪拌形成白色乳液，加入77.04mg 引發劑KPS，在這個體系中通15min氮氣，并用真空硅脂將燒瓶密封。將燒瓶放在50℃水浴中，以250r/min的攪拌速率反應12h。反應結束后，先讓體系緩慢冷卻至室溫，再用高速離心機分離制備的微球，分別用甲醇和乙腈洗滌以除去未反應的物質。將微球放在甲醇∶乙酸（9∶1，體積比）混合溶液中超聲來提取模板分子TNT，每隔1h換1次溶液，直到提取液中檢測不到TNT的紫外吸收峰。將制得的聚合物分別使用乙醇、甲醇洗滌數次，放在40℃真空干燥箱中干燥12h，從而得到分子印跡聚合物微球MIPs。按照上述步驟，在制備過程中不加入TNT，得到非印跡聚合物NIPs。

1.3 聚合物的吸附實驗

1.3.1 平衡吸附實驗

稱取15mg MIPs 或NIPs 于10mL 離心管中，依次加入0.01～0.1mmol/mL 的TNT 的乙腈溶液5mL。將密封好的離心管置于振蕩器中，25℃下振蕩5h。用高速離心機離心分離，并取適量離心后的溶液用0.22μm 膜過濾。用高效液相色譜分析儀測定在245nm處的吸附溶液中的TNT濃度，平行測定3次取平均值。根據吸附前后溶液中TNT 含量的變化，使用式(1)計算聚合物對TNT的平衡結合量Q[1]。

式中，Q 是MIPs 和NIPs 對模板分子TNT 的平衡吸附量，mmol/g；C0是吸附溶液中TNT的初始濃度，mmol/mL；C是吸附平衡時溶液中的TNT濃度，mmol/mL；V 是吸附溶液的體積，mL；m 是加入樣品的質量，mg。

1.3.2 吸附動力學實驗

稱取20mg MIPs或NIPs分散于5mL 0.1mmol/mL的TNT 的乙腈溶液中，將混合液置于振蕩器中，在不同時間內結束振蕩，離心分離吸附劑和吸附液。吸附液用0.22μm 膜過濾，用高效液相色譜分析儀測定吸附液中TNT的濃度，平行測定3次取平均值。同樣根據式(1)計算吸附劑對TNT的吸附量。

1.3.3 選擇性吸附實驗

為了驗證聚合物的特異吸附性，用DNT 與RDX 作為吸附競爭物，分別測定MIPs 與NIPs 對TNT 及其結構類似物的吸附能力。稱取15mgMIPs于10mL離心管中，分別加入5mL不同濃度的TNT、DNT、RDX 的乙腈溶液，25℃振蕩5h。離心分離吸附劑和吸附液，吸附液用0.22μm 膜過濾，測定樣品對不同底物的吸附量，平行測定3 次取平均值。分離系數由式(2)計算。

式中，cp表示聚合物結合底物的濃度，cs表示溶液中底物的平衡濃度。

1.4 分子印跡電化學傳感器的制備

電化學工作站三電極系統的組成包括：裸玻碳（GEC） 或者修飾玻碳電極（工作電極，直徑3mm）、鉑絲電極（對電極）與飽和甘汞電極（參比電極）。其中，把裸玻碳電極用0.05μm 的Al2O3粉末在麂皮上拋光成鏡面，再依次用硝酸溶液（水與硝酸的體積比為1∶1）、無水乙醇和2 次蒸餾水超聲5min，在室溫下晾干待用。然后把0.05g 殼聚糖固體溶于10mL 乙酸溶液（2.0mol/L）中，配制成質量分數為0.5%的殼聚糖溶液，在1mL0.5%的殼聚糖溶液中加入20mg MIPs或NIPs。將混合溶液超聲30min，取10μL 溶液涂滴在處理好的裸玻碳電極表面（表面涂覆法），過夜晾干[9]。

用NaH2PO4和Na2HPO4配制磷酸鹽緩沖液（PBS，0.2mol/L，PH=7）。以0.2mol/L 的PBS 溶液為支持電解質，用差分脈沖伏安法（DPV）來除去修飾電極的模板分子TNT，當響應曲線不再變化時表明TNT完全去除。用2次水洗凈修飾電極，懸掛在空白PBS溶液上方，低溫下進行保存。

1.5 電化學測試條件

采用差分脈沖伏安法（DPV）來除去印跡材料中的TNT 分子以及得到傳感器的線性范圍和檢出限，采用循環伏安法（CV）來研究MIPs 修飾電極的電化學性質和TNT在修飾電極上的電化學響應。

差分脈沖伏安法表征：電壓范圍為-1～-0.1V，電壓增量為0.004V，振幅為0.05V，脈沖寬度為0.05s，采樣寬度為0.0167s，背景液為空白PBS。

循環伏安法表征：電壓范圍為-0.2～+0.6V，掃描速率為50mV/s，背景液為0.2mol/L 的KCl 和5.0mmol/L的K3[Fe(CN)6]混合溶液。

2 結果與討論

2.1 TNT與MAA相互作用表征

選擇甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，驗證MAA 能否與模板分子TNT 形成穩定的復合物。在濃度4mmol/L 的MAA 乙醇溶液中加入TNT，超聲30min 充分混合后，其紫外吸收譜圖如圖1。可以看出隨著TNT 含量的增大，溶液的紫外峰型逐漸變寬，最大紫外吸收波從331nm 處紅移至373nm，吸收峰強度不斷增大。說明TNT 和MAA 之間產生了相互作用力，可能是由于TNT 分子中的硝基與MAA 分子中的羧基之間形成了氫鍵。在聚合過程中，TNT與MAA的摩爾比選為1∶4。隨著MAA濃度的增大，TNT 與MAA 的作用力也會增大，但是增加的幅度有限，并且過量的MAA 可能會使單體自聚以及產生未完全聚合的殘基，導致制備的MIPs的純度降低，特異吸附性能下降。

圖1 MAA與TNT不同摩爾比溶液的紫外光譜圖

2.2 聚合物的紅外表征

圖2 是樣品的紅外譜圖，其中a 是模板分子TNT洗脫之前的MIPs，b是未加入模板分子制得的NIPs，c是甲醇∶乙酸（9∶1體積比）混合溶液洗脫后的MIPs。在a中，2994cm-1處出現吸收峰是樣品中—CH2—的振動引起的，1730cm-1處出現吸收峰是交聯劑EDGMA 中的C==O 的振動引起的，1542cm-1處的吸收峰是TNT分子中苯環的骨架振動引起的，1355cm-1處的吸收峰是TNT 分子中－NO2伸縮振動引起的。a 與b 的對比證明了MIPs 中TNT的存在。在c中，可以看出TNT的苯環和硝基吸收峰發生了明顯減弱，洗脫后的MIPs 曲線和NIPs 曲線接近一致，這說明在聚合過程中結合在MIPs 中的大部分TNT 被洗脫出來，從而在MIPs 中留下了與TNT 形狀、大小完全匹配的空穴，實現了對模板分子TNT的特異性吸附。

2.3 聚合物制備條件的優化

2.3.1 溶劑對聚合物形貌的影響

根據本文1.2 節中的實驗方案，保持其他反應條件不變，只改變加入的溶劑乙腈的用量，研究其對樣品形貌和粒徑的影響。如圖3所示，乙腈的用量為10mL 時樣品的形狀為球形，大小分布不均勻；乙腈的用量為30mL 時聚合物的形貌規則，分散性較好，沒有粘結現象；乙腈的用量為50mL時，樣品之間互相粘結，形成少量微球。因此選擇溶劑乙腈的用量為30mL。

圖2 樣品的紅外譜圖

2.3.2 乳化劑用量對聚合物形貌的影響

根據本文1.2 節中的實驗方案，保持其他反應條件不變，只改變加入的乳化劑SDBS 的用量，研究其對樣品表面形貌的影響[10]。如圖4 所示，當SDBS 用量為6mg 時，乳液出現分層現象，無法混合均勻，樣品粘連，難以形成微球；當SDBS 用量為12mg 時，乳液乳白細膩，穩定性強，樣品顆粒均勻；當SDBS用量為30mg時，乳液黏度增大，所形成的樣品微球粒徑出現球型，但相互粘結，分散較差。因此選擇SDBS用量為12mg。

2.3.3 模板分子對聚合物形貌的影響

根據本文1.2 節中的實驗方案，研究制得的MIPs和NIPs的形貌差別。如圖5，相同條件下制備的MIPs與NIPs形態相似，但是NIPs的粒徑略大于MIPs，同時樣品發生了粘連。這可能是因為加入TNT 后，TNT 和MAA 之間的氫鍵作用力減少了MAA 單體的自聚。單個MIPs 中的TNT 含量增加，聚合過程更容易發生鏈轉移和終止，因此在一定程度上導致了最終形成的樣品粒徑減小[11]。

圖3 不同的乙腈用量制備聚合物的SEM圖

圖4 不同的SDBS用量制備聚合物的SEM圖

圖5 不同模板分子制備聚合物的SEM圖

2.4 聚合物的吸附性能

2.4.1 平衡吸附性能

在0.01～0.1mmol/mL濃度范圍內，測定MIPs和NIPs 對TNT 的吸附量。如圖6，在此濃度范圍內，當TNT 濃度增大時，MIPs 和NIPs 的吸附量都隨之增大，而MIPs 對TNT 的吸附量遠高于NIPs。當TNT的濃度達到0.04mmol/mL 時，NIPs對TNT的吸附量已趨于飽和。因為在洗脫模板分子TNT 后，MIPs 的內部留下與模板分子相對應的印跡空穴和功能基團，所以MIPs 對TNT 的吸附能力更好[12]。而NIPs 在經過交聯聚合后，內部形成緊湊的空穴結構，功能單體的活性基團大多被包埋在NIPs 內部，所以與TNT 的結合則更多依靠表面的物理吸附作用[13]。

圖6 MIPs和NIPs對不同濃度TNT的吸附曲線

為了研究聚合物對TNT 的結合特性，用Scatchard 方程對平衡吸附數據進行分析擬合，Scatchard方程式如式(3)。

式中：Q 是吸附平衡時聚合物對TNT 的吸附量，mmol/g；C 是吸附平衡時溶液中TNT 的濃度，mmol/mL；Qmax是最大表觀結合量，mmol/g；Kd為離解常數。

再使用Q/C 對Q 作圖，進行線性擬合，如圖7所示，線性擬合方程是Q/C = 209.88- 3.118Q。MIPs 對于TNT 的化學吸附存在一種結合位點，是由于TNT 的硝基與MAA 的羧基之間形成了氫鍵[14]。

2.4.2 吸附動力學

圖7 MIPs對TNT吸附量的Scatchard方程擬合

固定乙腈溶液中的TNT 濃度為0.1mmol/mL，MIPs 的用量為20mg，測定吸附不同時刻樣品對TNT 的吸附量，研究MIPs 和NIPs 對TNT 的吸附速率，如圖8?？梢钥闯?，MIPs對TNT的吸附速率遠大于NIPs。在140min 時，MIPs 吸附速率降低，吸附量達到了總吸附量的95%，吸附過程趨于平衡。而在80min 時NIPs 的吸附過程趨于平衡。MIPs 中分布著空穴結構，因此在吸附開始階段MIPs 外表面有著大量空白的印跡結合位點，對模板分子的結合速率較高，對TNT 的吸附量也迅速增加；當吸附過程進行到一定程度時，外表面的結合位點趨于飽和，TNT 便開始向MIPs 的內部擴散，產生空間位阻效應導致MIPs 對TNT 的吸附速率明顯下降，最終達到飽和。而NIPs 對TNT 的吸附則更多依靠樣品表面的物理吸附作用[15]，因此吸附速率較低，吸附很快就達到平衡。

圖8 MIPs和NIPs的吸附動力學曲線

2.4.3 吸附選擇性

選擇TNT 的結構類似物RDX 和DNT 作為吸附競爭物。如圖9，隨著底物濃度的增大，MIPs 對3種物質的吸附量均不斷增大，但MIPs 對TNT 的吸附量遠高于RDX 和DNT。表1 是MIPs 對不同濃度的底物的分離常數及選擇性系數計算結果。選擇性識別因子α 定義為兩種不同底物的分離系數之比。由表可以得出，在3種濃度條件下，MIPs對TNT的分離常數遠大于RDX 和DNT，對RDX 和DNT 的選擇性系數均大于4.4，說明MIPs對TNT有較好的選擇性吸附能力。

2.5 分子印跡電化學傳感器的表征

2.5.1 修飾電極在鐵氰化鉀中的表征

為了除去印跡材料中的TNT 分子，采用DPV法[9]來研究該傳感器在1mg/mL 的TNT 乙腈溶液中吸附不同時間的響應曲線，如圖10?？梢钥吹剑S著傳感器的不斷掃描，DPV 的響應電流越來越小，TNT 的硝基在轉化為胺基后與MAA 的氫鍵斷裂，從材料中洗脫出來，掃描22 次后，修飾電極的DPV 響應曲線幾乎不再變化，這表明模板分子已完全去除。

圖9 MIPs對TNT及其結構類似物的吸附量

表1 MIPs對不同濃度底物的分離常數及選擇性系數

圖10 MIPs修飾電極在PBS中去除TNT的DPV曲線

通過鐵氰化鉀探針，采用CV法研究MIPs修飾電極的電化學性質。圖11 分別對應裸玻碳電極與不同修飾電極在鐵氰化鉀溶液中的伏安特性曲線?？梢钥闯?，裸玻碳電極有1 對可逆的氧化還原峰，峰電流響應之比約為1∶1。而在MIPs 和NIPs的修飾電極中，K3Fe(CN)6的可逆氧化還原峰值響應明顯變小，電極表面修飾的膜嚴重阻礙了電子和質子在玻碳電極表面與溶液中的傳遞過程。當MIPs 中的TNT 完全洗脫之后，修飾電極對K3Fe(CN)6的氧化還原峰值顯著提高，證明洗脫后MIPs 中存在印跡空穴。但是洗脫后MIPs 修飾電極的峰電流仍然比裸玻碳電極低，因為聚合膜致密的表面結構對[Fe(CN)6]3－離子向電極表面的擴散過程產生了阻礙，導致[Fe(CN)6]3－只能通過印跡空穴擴散到電極表面來進行氧化還原反應。

圖11 玻碳電極及不同修飾電極在鐵氰化鉀中的CV曲線

2.5.2 TNT在修飾電極上的響應分析

采用CV法來考察TNT在修飾電極上的響應。將裸玻碳電極、MIPs與NIPs修飾電極放入0.5mg/mL的TNT乙腈溶液中富集4min，用2次水沖洗電極，接著浸入空白的PBS溶液中來考察其循環伏安響應[16]。如圖12，MIPs與NIPs都有1對可逆的氧化還原峰，其中相比較NIPs，MIPs的峰型更尖銳和集中，峰電流更大，峰電位差更小。而裸玻碳電極對TNT幾乎沒有響應。因此可以得出MIPs對TNT有良好的吸附能力，印跡材料的吸附量也更大。這是因為MIPs中印跡的模板分子TNT洗脫后，在印跡材料的表面會形成與TNT匹配的空穴，能夠有效富集且特異性識別溶液中的TNT。而NIPs修飾電極中沒有與TNT結合的印跡空穴，所以對TNT的吸附則相對很少。裸玻碳電極在經過2 次水沖洗后，幾乎沒有吸附模板分子。

圖12 修飾電極吸附TNT后的CV曲線

2.5.3 富集時間的影響

如圖10，在DPV 掃描過程中，MIPs 的修飾電極有3 個還原峰，峰電位大約分別-0.43V、-0.58V、-0.73V，對應TNT的苯環上3個硝基先后得電子轉變為胺基的電化學還原過程。?。?.43V處的還原峰進行分析。圖13 是在0～5min 內，富集不同的時間-0.43V 電位處的峰電流值。隨著富集時間的增加，峰電流增大，當富集3min 時達到最大電流值的94%，且MIPs 修飾電極在5min 內達到吸附平衡。實驗表明，在吸附過程中MIPs 修飾電極對TNT 的結合速率很快，這是因為印跡薄膜上有較大的比表面積和較多的印跡位點[17]。由于薄膜的大量印跡位點都位于表面，TNT更容易進入印跡位點，因此TNT 與印跡薄膜之間的傳質阻力較小，可以很快地達到吸附平衡。

圖13 富集不同時間－0.43V電位處的峰電流值

2.6 傳感器的性能

2.6.1 線性范圍和檢出限

采用DPV法研究不同濃度的電化學還原行為。將修飾好的電極浸入一定質量濃度的TNT 乙腈溶液中，來獲取傳感器的線性檢測范圍和最低檢出限[18-19]，對-0.43V處的還原峰進行分析。圖14是富集不同濃度TNT乙腈溶液4min后的DPV響應曲線，可以看出，當TNT 的濃度增大時，-0.43V 處峰電流也不斷增大，峰電流大小與0.1～5mg/mL 范圍內的TNT 濃度呈線性關系，校正曲線見圖15，線性方程為y=5.62x+2.33，TNT 的檢出限為0.06mg/mL(S/N=3)，線性相關系數為0.996。因此可以得出，修飾的傳感器對TNT的檢測有很好的靈敏度。

2.6.2 修飾電極對TNT的選擇性

圖14 MIPs修飾電極隨著TNT濃度增加的DPV響應曲線

圖15 MIPs修飾電極的校正曲線

為了衡量傳感器的性能，將其應用于對TNT的特異性識別，用DNT 和RDX 作為對比，考察修飾電極的選擇性吸附[20]。圖16 是MIPs 和NIPs 傳感器在-0.43V 處的DPV 響應電流，很明顯地看出MIPs 傳感器對TNT 的響應電流最大，分別是DNT和RDX的3.13倍和3.27倍。而NIPs傳感器對TNT、DNT 和RDX 的響應電流相差不大。觀察三者的結構，DNT 和TNT 的結構比較接近，但DNT 的苯環上比TNT 少了1 個硝基，導致與MAA 的相互作用力更薄弱，所以MIPs 對其雖有一定的吸附作用，但吸附能力更差。以上數據表明，MIPs 傳感器表面的結合位點可以與TNT 進行特異性結合，構建的MIPs 傳感器對TNT 分子具有很強的特異性識別能力。

圖16 修飾電極對TNT的選擇性吸附

3 結論

（1）以MAA 為功能單體，TNT 為模板分子，采用乳液聚合法制備TNT的分子印跡聚合物MIPs。將制備的MIPs 分散在溶劑中，通過表面涂覆法制備出TNT的分子印跡電化學傳感器。

（2）當溶劑用量為30mL、乳化劑用量為12mg時，制備的MIPs 形貌規則、粒徑均勻。MIPs 對TNT 的吸附量隨著TNT 初始濃度的增加而增加，140min 后達到最大吸附量的95%。MIPs 對TNT 的分離常數遠大于RDX 和DNT，對RDX 和DNT 的選擇性系數均達到4.4以上，說明MIPs對TNT有較好的選擇性吸附能力。

（3）鐵氰化鉀探針實驗和對TNT 的響應曲線驗證了電化學傳感器的成功制備，富集時間實驗得出該傳感器富集3min 就可以達到最大電流值的94%。

（4）檢測范圍實驗和選擇性吸附實驗表明當TNT 的濃度在0.1～5mg/mL 范圍內時，可與峰電流呈現良好的線性關系，檢出限是0.06mg/mL。該傳感器對TNT 的電流響應分別是DNT 與RDX 的3.13倍和3.27倍，表現出很強的特異性識別能力。這種TNT的分子印跡電化學傳感器有望給快速、靈敏地檢測TNT 以及開發研制便攜式檢測儀器等工作提供新的思路。