自體富血小板血漿促進兔脛骨牽張成骨新骨形成的實驗研究

湯麗國，任志勇，劉增運，王輝，霍繼貞

（1.山東陽光融和醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 262100；2.中國人民解放軍陸軍第80集團軍醫(yī)院 創(chuàng)傷骨二科，山東 濰坊 261021）

富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）是自體全血通過離心、分離后得到的濃縮血小板，內(nèi)有含量豐富的血小板。血小板的主要作用是凝血，當血小板被激活劑激活時，能釋放多種生長因子，包括血小板源性生長因子（PDGF）、胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和血小板源性血管生成因子（PDAF）等，它們共同參與組織修復。有研究報道稱PDGF與IGF能共同促進骨再生。PRP的制備工藝相對簡單，對實驗設(shè)備要求較低，且在應(yīng)用過程中沒有排異性，目前在國內(nèi)外已有使用PRP來修復骨與軟組織損傷的大量報道，并在動物實驗及臨床實驗研究中均取得了顯著的療效[1-4]。但在大段骨缺損牽拉成骨中應(yīng)用PRP的效果并不確切，爭議不斷。我們通過動物實驗來探究不同時期應(yīng)用自體富血小板血漿在牽張成骨過程中對延伸區(qū)新骨形成質(zhì)量的影響，并為臨床在縮短牽張成骨過程中新生骨的礦化過程、加速骨愈合提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

中國成年家兔（體重2.0～2.5 kg）共48只，雌雄不限，無差別飼養(yǎng)。隨機分A、B、C三組，每組16只，其中A、B組為實驗組，分別在開始牽張和牽張結(jié)束后給予牽張間隙內(nèi)注射富血小板血漿（PRP）0.5 mL與激活劑（牛凝血酶、10% CaCl2）混合形成得膠樣物質(zhì)；C組作為空白對照不注射任何物質(zhì)。

1.2 動物模型的制作

本模型所采用的骨延長器為人掌骨所使用的雙邊外固定器，其延長機理與Ilizarov外固定架相同。氯胺酮肌注麻醉，無菌條件下，自兔左側(cè)脛骨前內(nèi)側(cè)中上段作縱行切口，確定截骨平面為脛骨干骺端處，在截骨面上下各1.0cm處平行打入兩枚克氏針，安裝外固定架，線鋸截骨，在脛骨截骨平面以遠約0.5 cm水平將腓骨楔形截骨，沖洗后刀口仔細縫合，無菌敷料包扎。術(shù)后第8天開始以1.0 mm/d速度延長，分兩次完成，共牽拉10 d，總計長度為1.0 cm，隨后即進入固定期。其中A、B組分別在開始牽張和牽張結(jié)束后予牽張間隙內(nèi)注射富血小板血漿（PRP）0.5 mL與激活劑（牛凝血酶、10% CaCl2）混合而形成的凝膠樣物質(zhì)；C組正常牽張，不做其他處理。

1.3 PRP的制備

嚴格無菌消毒條件下，自兔耳中央動脈取血，采用Landesberg法制備PRP[5]，用無菌注射器吸取0.5 mL PRP，將其與牛凝血酶、10% CaCl2混合形成的凝膠樣物質(zhì)注入截骨間隙內(nèi)。

1.4 觀察指標

組織學檢查：固定期第35天在骨牽張間隙內(nèi)取材，觀察各組延長間隙內(nèi)新生骨形成情況，檢測各組牽張成骨區(qū)骨形成、鈣鹽沉積及骨細胞生長情況。

骨密度測定：在牽張成骨固定期的第42天隨機取材，首先采用 Hologic Q DR-2000雙能X線骨密度儀（陸軍第80集團軍醫(yī)院實驗中心）測定牽張成骨區(qū)的骨密度。

扭轉(zhuǎn)實驗：將測定骨密度的牽張成骨標本用CSS-4000萬能材料測試儀測量牽張區(qū)新生骨的最大扭矩、扭轉(zhuǎn)角；計算新生骨的抗扭強度及剛度：Tb(抗扭強度)=Mn(最大扭矩)/Wn(抗扭截面模量)，GJP(抗扭剛度)=Mn·l(長度)/θ(扭轉(zhuǎn)角)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察

A組骨小梁密度較低，可見炎性細胞增多，少量的破骨細胞，其間被大量的纖維組織填充，成骨細胞數(shù)量較少。B組骨小梁布列較為緊密，纖維組織發(fā)育成熟，成骨細胞數(shù)量較其他組有所增多，可見哈弗斯管。C組骨小梁密度相對較低，有大量未成熟的纖維組織填充，炎性細胞成骨細胞數(shù)量較少（圖1）。

圖1 各組固定期第35天牽張間隙新生骨組織（HE染色×100）

2.2 骨密度測定

采用SPSS 20.0統(tǒng)計程序分析牽張成骨區(qū)新生骨骨密度測定數(shù)據(jù)結(jié)果。各組骨密度數(shù)據(jù)行方差分析，兩組間配對行t檢驗。PRP組的BMD相對值（%）明顯高于空白組（P＜0.05）；B組骨密度測定優(yōu)于C組（P＜0.05，表1)。

表1 三組骨密度測試結(jié)果比較（±s）

表1 三組骨密度測試結(jié)果比較（±s）

組別 BMD（g/cm2）A組 (PRP) 0.1005±0.027 B組 (PRP) 0.1319±0.033 C組 (空白組) 0.0799±0.029

2.3 生物力學測試

生物力學扭力測試結(jié)果顯示PRP組的測試數(shù)據(jù)優(yōu)于空白組（P＜0.05），而PRP組中B組載荷強度優(yōu)于C組（P＜0.05），B組載荷強度最大(表2)。

表2 三組扭力測試結(jié)果比較（±s）

表2 三組扭力測試結(jié)果比較（±s）

組別 Mn(kg·cm) Tb(g/mm2) GJP(gcm2/度) θ(度/cm)（最大扭矩） （抗扭強度） （抗扭剛度）（單位長度扭轉(zhuǎn)角）A組 8.35±0.77 1501.94±14.73 3544.13±515.94 1.7025±0.25 B組 9.31±0.74 1517.22±10.67 4012.00±573.68 2.7088±0.24 C組 7.55±0.93 1497.22±13.77 2580.30±513.00 1.5325±0.43

3 討論

3.1 觀察背景

牽張成骨技術(shù) (distraction osteogenesis，DO)在修復各種原因造成的大段骨缺損以及正畸等方面得到大家的重視，臨床已經(jīng)比較成熟，但在治療過程中會存在各種并發(fā)癥，長期外固定支架也會給患者心理造成一定創(chuàng)傷[6-8]。減少并發(fā)癥的一個有效途徑就是縮短牽張成骨新生骨的成骨時間，有效促進新生骨的成骨質(zhì)量。當前的研究表明，牽張成骨的結(jié)果受機械性以及生物性因素的影響，多種因子的調(diào)控在骨愈合過程中也起著至關(guān)重要的影響。

富血小板血漿 (Platelet-rich plasma，PRP)通過一些方法激活血小板，使得血小板顆粒釋放出多種生長因子，其中包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板衍化生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等，它們都對細胞的生長分化及組織生長有重要的作用，并可促進組織血管形成，加快新生骨的血管化，促進骨愈合。我們基于富血小板血漿的這些特性設(shè)計了這個實驗，利用富血小板激活后釋放的多種因子促進牽張成骨新生骨的礦化。

3.2 結(jié)果分析

在固定期第35天于骨牽張間隙內(nèi)取材，觀察各組延長間隙內(nèi)新生骨形成情況。HE染色結(jié)果顯示PRP組延長區(qū)的骨小梁較空白組排列更為緊密，其間填充有成熟纖維組織，成骨細胞數(shù)較多，并見成熟哈弗斯管結(jié)構(gòu)，骨的重塑較為活躍，并有多個軟骨化中心出現(xiàn)。因此推斷在牽張間隙內(nèi)注射PRP對家兔脛骨牽張區(qū)的成骨質(zhì)量有顯著的加速作用。我們對家兔脛骨牽拉成骨區(qū)的新生骨質(zhì)作了骨密度測定，并測定牽張成骨區(qū)新生骨的生物力學強度。測試結(jié)果顯示實驗組優(yōu)于空白對照組，進一步證實了富血小板血漿對牽張區(qū)成骨質(zhì)量有明顯的促進作用，而實驗組中B組的測定結(jié)果明顯優(yōu)于A組，我們推測在牽張結(jié)束后的固定早期應(yīng)用PRP可以顯著促進牽張成骨新生骨礦化進程。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)實驗組A組在牽張早期應(yīng)用PRP后，牽張區(qū)皮膚炎癥反應(yīng)征象較B、C組明顯，出現(xiàn)皮溫升高、局部略紅腫征象，因此我們推斷在牽張期注射富血小板血漿(PRP)后，加重了延長區(qū)的局部炎癥。這期間的PRP可能參與了局部的炎癥反應(yīng)，未能參與到后期的牽張區(qū)新生骨礦化的過程。

PRP來自于自身的血液，排異性小，使用相對安全，并且制作過程簡便。自1984年首次報道PRP中的生長因子能促進骨缺損修復后，人們便迅速掀起了PRP的相關(guān)研究[9]。目前大量研究已在使用 PRP結(jié)合組織工程手段，利用PRP在體內(nèi)具有促進骨再生的作用，結(jié)合干細胞或生物材料來治療骨不連、軟組織損傷等，尤其是 PRP結(jié)合支架材料治療骨缺損時，實驗組的成骨量明顯優(yōu)于對照組，這表明生物材料提高了PRP的效能，使其能夠充分發(fā)揮作用[10-11]。而本實驗中牽張成骨區(qū)所形成的初期骨痂，為PRP提供了這種內(nèi)環(huán)境，作為一種天然的生物支架結(jié)構(gòu)，使PRP充分發(fā)揮效能。PRP在促進骨再生的過程中主要通過在骨缺損的局部微環(huán)境中釋放一些生長因子，而這些生長因子是骨生長再生中所必需的。它們之間通過復雜的互相作用，精密的調(diào)節(jié)協(xié)同促進骨再生[12-13]。

本實驗通過在家兔脛骨骨缺損治療上與PRP聯(lián)合應(yīng)用，來探究在牽張成骨過程中應(yīng)用PRP對成骨的影響，我們的研究觀察到骨愈合的初期PRP對牽張成骨新生骨的再生起到了促進作用，特別是在牽張結(jié)束后的骨礦化期應(yīng)用PRP顯著促進了牽張成骨的新生骨礦化進程。