HPLC測定紫玉米中花青素的含量

孟俊文 田翔

摘要 ? ?將紫玉米中的花青素經(jīng)過酸化乙醇溶液超聲加熱提取，使花青素水解為一些常見的花色素。選用高效液相色譜儀，以1%甲酸水溶液和1%甲酸乙腈溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，在530 nm波長處對飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素等6種常見花色素進(jìn)行定量檢測。結(jié)果表明，在濃度0.2～100.0 mg/L范圍內(nèi)，6種花色素濃度與響應(yīng)值呈線性關(guān)系，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)，R2>0.99;6種花色素的平均回收率為88%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值為0.5%～3.9%。

關(guān)鍵詞 ? ?紫玉米;花青素;高效液相色譜

中圖分類號 ? ?O657.7+2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）17-0210-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract ? ?Anthocyanin in purple corn were extracted by ultrasonic heating in acidified ethanol solution and hydrolyzed into some common anthocyanins. Six common anthocyanins （delphinidin， cyanidin， petunidin， pelargonidin， peonidin， malvidin） were quantitatively detected at 530 nm wavelength by gradient elution using 1% formic acid solution and 1% formic acetonitrile solution as mobile phase. The results showed that in the range of concentration of 0.2 mg/L to 100.0 mg/L， there was a linear relationship between six anthocyanins concentrations and the response value， and the standard curve equation and correlation coefficient were obtained respectively， R2>0.99. The average recoveries of the six anthocyanins ranged from 88% to 106%， and the relative standard deviation values ranged from 0.5% to 3.9%.

Key words ? ?purple corn; anthocyanin; HPLC

花青素是一類水溶性植物色素，可呈現(xiàn)紅、藍(lán)、紫等不同顏色。其廣泛存在于植物的花、莖、葉以及果實中，花青素在自然條件下很少以游離狀態(tài)存在，這一類水溶性植物色素常常與各種單糖通過糖苷鍵結(jié)合形成花色苷[1]。原花青素是目前世界上公認(rèn)最有效的天然抗氧化劑，有效清除存在于人體內(nèi)的自由基，恢復(fù)代謝平衡，具有美容、抗衰老和抗癌活性。基于這些功能，原花青素在很多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景。紫玉米是含有酚類化合物（phenolic compounds）和花青素（anthocyanidins）的作物，因為具有一定的健康性和營養(yǎng)性，所以受到人們的關(guān)注。此外，紫玉米花青素還具有無毒、安全、藥食兼用等特性，可作為一種天然色素，在食品工業(yè)、化妝品行業(yè)以及布匹染料等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。在未來的研究中發(fā)展更多更好的花青素提取和檢測方法，進(jìn)而發(fā)揮出花青素的營養(yǎng)功效，可為人類的健康服務(wù)[2]。

自然存在的花青素種類繁雜，常見的花色素有6種，分別是飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素。目前，對紫玉米花青素含量的測定方法主要有紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法[3]等。花青素通過強(qiáng)酸水解可以轉(zhuǎn)化成上述6 種常見花色素中的1種或幾種。因此，總花青素含量可以通過分析花色素來確定。本試驗運用高效液相色譜法測定紫玉米中花青素種類及含量，以期為紫玉米花青素的研究提供參考[4]。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

試驗藥劑有：無水乙醇（優(yōu)級純），甲酸（色譜純），甲醇（色譜純），鹽酸（優(yōu)級純），超純水（密理博超純水機(jī)過濾）;芍藥色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度>97%），矢車菊色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度>98%），矮牽牛色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度>96%），錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（>97%），飛燕草色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度>97%），天竺葵色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度>96%），均購自北京索萊寶科技有限公司。

儀器與設(shè)備有：Agilent 1200液相色譜儀（美國Agilent公司），賽多利斯BAS124S電子天平（精度0.0001 g），純水機(jī)（法國Millipore公司），高速旋風(fēng)研磨機(jī)（德國IKA公司），MS3 basic渦旋混勻器（德國IKA公司），水浴鍋（上海博迅實業(yè)發(fā)展有限公司），超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?標(biāo)準(zhǔn)溶液制備。分別精密稱取錦葵色素、牽牛花色素、芍藥色素、飛燕草色素、天竺葵色素、矢車菊色素6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各1.0 mg，分別用10%鹽酸甲醇溶液溶解，并定容至5 mL，充分搖勻，配制成200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18 ℃條件下，貯存于密閉的棕色玻璃瓶中。

1.2.2 ? ?樣品前處理。將紫玉米用高速旋風(fēng)谷物研磨機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取5.000 0 g，置于50 mL具塞比色管中，加入酸化乙醇，定容至刻度，搖勻，超聲提取30 min，然后置于沸水浴中水解1 h，取出冷卻后，用酸化乙醇提取液再次定容。靜置，取上層清液，用0.45 μm水相濾膜過濾，封入2 mL棕色進(jìn)樣瓶中，于4 ℃條件下保存待測[5-6]。

1.2.3 ? ?色譜條件。色譜柱：Agilent-ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）;流動相為1%甲酸水溶液（A）和1%甲酸乙腈溶液（B）;流速為0.8 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測波長530 nm;進(jìn)樣體積20 μL。梯度洗脫條件見表1。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別用10%鹽酸甲醇溶液配制6種花色素的混標(biāo)溶液，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2所示，6種花色素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在0.2～100.0 mg/L范圍內(nèi)與相應(yīng)的響應(yīng)信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)稱樣量1 g，定容體積50 mL，以3倍信噪比計算儀器檢出限。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜分離定性，保留時間9.600 min的為飛燕草色素，保留時間11.550 min的為矢車菊色素;保留時間12.069 min的為矮牽牛色素，保留時間14.692 min的為天竺葵色素，保留時間15.529 min的為芍藥色素，保留時間15.826 min的為錦葵色素（圖1）[7-8]。

2.2 ? ?穩(wěn)定性試驗

取同一紫玉米樣品提取液，按同樣的色譜條件，將樣品分別放置0、2、4、6、8、12、24 h后進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSD值在0.4%～3.1%，這說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，在24 h以上時部分花青素降解[9]。

2.3 ? ?回收率和精密度

分別向紫玉米空白試樣中添加6種花色素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種花色素的添加質(zhì)量濃度各不相同，分別設(shè)計3個濃度水平，每個水平設(shè)計3個重復(fù)，與空白試樣一同進(jìn)行測定。結(jié)果表明，6種花色素的平均回收率為88%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～3.9%，回收率、精密度均能滿足檢測要求[10]。

2.4 ? ?樣品測定

應(yīng)用以上1.2.2方法對紫玉米樣品進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，被檢樣品中含有4種花色素，分別為飛燕草色素（28 mg/kg）、矢車菊色素（830 mg/kg）、芍藥色素（253 mg/kg）、錦葵色素（395 mg/kg）。其他2種色素未檢出，所檢測的紫玉米樣品中總花青素的含量可達(dá)1 506 mg/kg。

3 ? ?結(jié)論與討論

本研究建立了高效液相色譜法對紫玉米中6類花青素定量的方法。方法采用酸化乙醇溶液經(jīng)沸水浴水解提取花青素。由于花青素在光照條件下易降解，因而在樣品制備和檢測過程中應(yīng)盡量避光，以保證樣品穩(wěn)定性。樣品采用安捷倫液相色譜儀，以1%甲酸水溶液和1%甲酸乙腈溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，在20 min內(nèi)樣品中花青素與干擾物有效分離，從而達(dá)到準(zhǔn)確定量。通過添加不同水平的6種花色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，證明本法精密度好、準(zhǔn)確度高。該方法的建立為紫玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)，為紫玉米的開發(fā)和利用提供了數(shù)據(jù)支撐，同時也可為其他植物樣中花青素檢測提供參考。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

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