QuEChERS結合UPLC-MS/MS測定水產品中9 種除草劑殘留及基質效應

李麗春，劉書貴，尹 怡，汪玉潔，鄭光明,，馬麗莎，單 奇，戴曉欣，趙 城，謝文平，魏琳婷

（1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業農村部水產品質量安全風險評估實驗室（廣州），農業農村部休閑漁業重點實驗室，廣東 廣州 510380；2.仲愷農業工程學院，廣東 廣州 510225）

隨著水產業的蓬勃發展，水產養殖中藥物殘留問題日益嚴重，已成為食品安全熱點問題之一。養殖池塘清除雜草和農田中使用的除草劑通過地表徑流和滲透進入江河湖泊，進而污染養殖水體，造成水產品中殘留除草劑，給消費者帶來安全隱患。近年來，我國稻漁綜合種養模式得到大力推廣，涉及全國20多個省，全國稻漁綜合種養面積2 800萬 畝，產量194.75萬 t，已成為水產養殖發展的一大亮點。我國是農業大國，除草劑的生產和使用位居世界前列，但由于不合理使用，60%的農藥殘留于環境中，對農產品造成污染[1]，水產養殖受水環境的影響較大，更易造成殘留危害[2]，大多數除草劑殘效期較長，可在生物體內富集，且部分除草劑對人體和動物有干擾內分泌系統的功能，甚至具有致癌性[3]。隨著人民對食品安全的越發重視，各國政府對水產品中除草劑等農藥加大了監管力度，并制定了嚴格的限量要求，日本制定的《食品中殘留農業化學品肯定列表制度》中多數農藥的限量值為0.01 mg/kg。目前水產品中除草劑殘留的測定方法大多集中在單一化合物的測定[4]，僅有三嗪類除草劑采用多殘留測定[5]。多類型除草劑在水產品中的同時檢測鮮見報道，因此開發靈敏可靠的除草劑多殘留檢測技術十分必要，可為水產品中多種除草劑的檢測分析和風險評估提供科學依據。

據報道，農藥多殘留測定多采用氣相色譜[6-7]、氣相色譜-質譜聯用[8-11]、氣相色譜-串聯質譜[8-9,12]、液相色譜[13]和液相色譜-串聯質譜[14-19]等，前處理方法大多采用均質振蕩和加速溶劑萃取[7]，凝膠滲透色譜和固相萃取[5,20-21]。QuEChERS是新開發的一種快速、簡便、低成本且環境友好的前處理方法，主要用于糧油作物[22-23]、茶葉[14,24]、水果[25]和蔬菜[26]等農產品中農藥多殘留測定[27]，近年來動物性食品中也有所應用[3,28-30]，但水產品中應用較少，水產品中多種除草劑的QuEChERS方法鮮見報道。本研究選擇0.1%甲酸-乙腈溶液為提取溶劑，中性氧化鋁為分散吸附劑，超高效液相色譜-串聯質譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測定，建立水產品中撲草津、乙草胺、丁草胺、二氯喹啉酸、芐嘧磺隆、甲磺隆、莠去津、利谷隆和滅草松的多殘留分析方法，該方法準確、快速、低成本且環境友好。同時對該方法下基質種類、基質質量和除草劑質量濃度對基質效應的影響進行分析研究，有望建立快速、高效和準確的適用于水產品中多類型除草劑殘留檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對蝦（9.0～12.0 cm）、鯉魚（700～1 000 g）、鯽魚（400～600 g）、鳙魚（1 000～2 000 g） 市購；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Burdick & Jackson公司；甲酸、乙酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；中性氧化鋁（A-N）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、弗羅里硅土、C18、石墨化碳黑（graphitizing of carbon black，GCB）（均為分析純）天津Agela公司；撲草津、乙草胺、丁草胺、二氯喹啉酸、芐嘧磺隆、甲磺隆、莠去津、利谷隆、滅草松標準品（純度＞98.0%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純） 廣州化學試劑廠；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

UPLC-Xevo TQD MS/MS儀（配備有電噴霧離子源及MassLynx V4.1數據處理系統） 美國Waters公司；MS3旋渦混勻器 德國IKA公司；Direct-Q3超純水機美國Millipore公司；TDL-5-A離心機 上海安亭公司；N-EVAP-12氮吹儀 美國Organomation公司；3k15高速離心機 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取適量的上述9 種除草劑標準品，分別用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的單標儲備液。分別移取上述單標儲備液0.1 mL，用甲醇定容于同一10 mL的容量瓶中，配制成10 μg/mL的混合標準中間溶液。采用系列稀釋法分別配制質量濃度為0.50、1.00、2.00、5.00、10、20、50 ng/mL和100 ng/mL標準工作溶液。所有標準溶液均于-18 ℃避光保存。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），B為甲醇；流速0.20 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 質譜條件

表2 質譜參數Table 2Optimized ESI MRM-MS instrument parameters

電噴霧離子源正離子模式；離子傳輸毛細管溫度350 ℃；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣流速為650 L/h，錐孔流速50 L/h，掃描模式為多反應監測，其他參數見表2。

1.3.4 樣品前處理

提取：準確稱取5.00 g已絞碎混勻的肌肉組織樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL蒸餾水和10 mL 1%甲酸-乙腈溶液，同時加入1.5 g氯化鈉和5.0 g無水MgSO4，高速渦旋混勻1 min，超聲10 min，5 000 r/min離心5 min。

凈化：上清液轉移至含200 mg中性氧化鋁的15 mL離心管中，高速渦旋30 s，5 000 r/min離心5 min。上清液轉移至15 mL玻璃離心管中，40 ℃氮氣吹干，用2 mL甲醇-5 mmol/L乙酸銨（1∶1，V/V）復溶，過0.22 μm微孔濾膜，待UPLC-MS/MS檢測。

1.3.5 基質效應

水產品中含量較高的蛋白質和脂肪等雜質易引起基質增強或基質抑制效應，有關研究表明基質種類、基質質量和除草劑質量濃度對基質效應有一定影響[31]。因此建立水產品中除草劑殘留分析方法應考慮基質效應對檢測結果的影響，本研究采用提取后加標法，分析基質種類、除草劑質量濃度和基質質量對基質效應的影響，以空白基質提取液與純溶劑中目標分析物峰面積的百分比評價基質效應[28,31-32]，按下式計算：

式中：Am為基質提取液中目標分析物峰面積；As為純溶劑中目標分析物峰面積。

1.3.6 實際樣品的測定

采集廣東省稻魚綜合種養模式下的鯉魚樣品10 份，每份樣品不少于10 尾，采用本研究建立的前處理方法和色譜條件測定其體內除草劑殘留量。

1.4 數據統計及圖表繪制

本研究所有數據均在Waters公司的MassLynx V4.1軟件下采集，采用MassLynx V4.1SCN843處理方法對檢測結果進行定性和定量分析。采用Excel 2016進行數據統計和表格制作，并采用GraphPad prism8.0進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

甲醇、乙腈和乙酸銨是液相色譜法測定除草劑等農藥殘留的常用流動相[33-34]，電噴霧離子源正離子模式下在流動相中加入一定量的甲酸，可以增加目標物的離子化狀態，提高其離子化效率，達到改善峰形，提高分離度的效果。通過優化色譜分離條件，可使目標物與抑制電離的基質實現最大程度的分離，降低基質效應。本研究比較甲醇-5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）溶液和乙腈-5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）溶液作流動相時目標物的響應，結果表明大部分目標物在甲醇-5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）溶液的流動相中有較高的響應且峰形尖銳對稱。因此本研究采用甲醇-5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）溶液為流動相。圖1為UPLC-MS/MS分析9 種除草劑的色譜圖。

圖1 9 種除草劑標準品的多反應監測色譜圖（10 ng/mL）Fig.1 MRM chromatograms of 9 herbicide standards (10 ng/mL)

2.2 提取溶劑的選擇

圖2 不同提取溶劑對9 種除草劑加標回收率Fig.2 Recoveries of 9 herbicides with different extraction solvents

除草劑等農藥的QuEChERS方法中大多采用甲醇、乙腈和酸化乙腈作為提取溶劑[35-36]。本研究在鳙魚肌肉中加入5.0 μg/kg的除草劑混合標準溶液，比較甲醇、乙腈、1%甲酸-乙腈溶液和1%乙酸-乙腈（V/V）溶液對9 種除草劑的提取效率。如圖2所示，甲醇的提取效率較差，9 種除草劑加標回收率在50%以下，其原因可能是甲醇鹽析效果不佳所致。乙腈在有效提取目標物的同時可沉淀蛋白，減少弱極性成分的提取，且鹽的加入可有效促進乙腈與水的分層，提高提取率。甲酸的酸性較強，1%甲酸-乙腈溶液pH值較低有利于酸性農藥（二氯喹啉酸）的提取，9 種除草劑平均回收率在80%～120%之間。因此采用1%甲酸-乙腈溶液作為QuEChERS的提取溶劑。

2.3 超聲時間對回收率的影響

圖3 超聲時間對回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasonication time on recoveries

采用基質加標的方法對超聲時間進行優化選擇。以5.0 μg/kg為加標量，分別超聲提取0、5、10、15 min和20 min，分析超聲時間對回收率的影響。如圖3所示，隨超聲時間的延長，加標回收率有所增加，尤其是二氯喹啉酸和甲磺隆，超聲提取可大大改善其回收率。超聲10 min時9 種除草劑回收率在94.49%～111.86%之間，而超聲15 min后莠去津、滅草松、甲磺隆和丁草胺回收率有所降低，因此本方法采用超聲提取10 min進行樣品前處理。

2.4 凈化過程的優化

圖4 凈化劑種類對加標回收率的影響（5.0 μg/kg）Fig.4 Influence of cleaning agent type on recoveries (5.0 μg/kg)

QuEChERS方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB、中性氧化鋁和弗羅里硅土，PSA通常用于去除提取液中的脂類和糖類物質，C18具有良好的除脂能力，GCB可去除提取液中的色素成分，但對含苯環官能團的化合物有較強的吸附作用。本研究優化比較PSA、C18、GCB、中性氧化鋁和弗羅里硅土5 種吸附劑對9 種除草劑的凈化效果。如圖4所示，在同一基質（鳙魚）中加入5.0 μg/kg的9 種除草劑混合標準溶液，分別用200 mg的上述5 種吸附劑凈化，比較其回收率。結果表明，GCB對9 種除草劑均有一定吸附性，對二氯喹啉酸、芐嘧磺隆、丁草胺、利谷隆和莠去津吸附較強，其回收率在60%以下；C18對丁草胺吸附較強，回收率僅為24.70%；弗羅里硅土對撲草津和滅草松有較強吸附性，其加標回收率低于30%；PSA對二氯喹啉酸吸附較強其回收率僅為50%。而采用中性氧化鋁對樣品進行凈化可獲得較好的回收率，9 種除草劑加標回收率在92.27%～103.42%之間。

圖5 中性氧化鋁用量對回收率的影響（5.0 μg/kg）Fig.5 Influence of amount of neutral alumina used on recoveries (5.0 μg/kg)

同時本研究對中性氧化鋁的用量進行優化選擇，采用空白鳙魚樣品添加5.0 μg/kg除草劑標準溶液，比較100、200、400、600、800 mg和1 000 mg中性氧化鋁的凈化效果。如圖5所示，中性氧化鋁用量對加標回收率有較大影響，100 mg中性氧化鋁凈化時，莠去津、甲磺隆和二氯喹啉酸回收率較低，在61.94%～81.65%之間，乙草胺、丁草胺和滅草松回收率均高于120%，可能原因是凈化不干凈基質效應較強。隨中性氧化鋁用量的增加，回收率呈降低趨勢，中性氧化鋁用量為200 mg時9 種除草劑加標回收率在98.03%～104.90%之間，回收率較好，本方法選擇中性氧化鋁用量為200 mg。

2.5 方法線性范圍、檢出限和定量限結果

采用系列稀釋法用甲醇-5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）（1∶1，V/V）的定溶液配制質量濃度分別為0.50、1.00、2.00、5.00、10、20、50 ng/mL和100 ng/mL的混合標準溶液，以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制校準曲線并做線性回歸分析。如表3所示，9 種除草劑在0.50～100 ng/mL（二氯喹啉酸和利谷隆1.00～100 ng/mL）范圍內線性良好，相關系數r大于0.99。在空白樣品中添加9 種除草劑，以信噪比為3和10分別計算檢出限和定量限，其檢出限為0.20～0.50 μg/kg，定量限為0.50～1.50 μg/kg。

表3 9 種除草劑線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs for 9 herbicides

2.6 回收率和精密度結果

表4 9 種除草劑在4 種水產品基質中的加標回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of 9 herbicides spiked into 4 aquatic products (n= 6)

采用基質加標法，在對蝦、鯉魚、鯽魚和鳙魚樣品中分別添加3 個質量濃度水平（定量限、3 倍定量限和5 倍定量限）的9 種除草劑，對其加標回收率和精密度進行考察，每個添加水平重復6 次。如表4所示，9 種除草劑在4 種水產品基質中的加標回收率和精密度分別為84.33%～116.37%和0.80%～13.81%，回收率和精密度均滿足國內外對水產品中除草劑殘留檢測的要求。

2.7 基質效應

采用建立的前處理方法和儀器條件，分別測定空白基質提取液和純溶劑中目標物的響應強度，通過二者峰面積的百分比評價基質效應。基質效應越接近100%，基質效應越小，大于100%，表面存在基質增強效應，相反基質效應小于100%，則存在基質抑制效應[32]。

2.7.1 除草劑質量濃度對基質效應的影響

采用提取后加標法，分析除草劑質量濃度（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL和100 ng/mL）在對蝦、鯉魚、鳙魚和鯽魚基質中的基質效應。如圖6所示，除草劑質量濃度對基質效應有一定影響，4 種基質中二氯喹啉酸、甲磺隆和芐嘧磺隆均存在基質增強效應，在鯉魚和對蝦中當除草劑質量濃度低于10 ng/mL時，基質增強效應較為明顯（＞150%）。在鯽魚和鳙魚中乙草胺、利谷隆、滅草松和莠去津基質抑制效應較為明顯，但受除草劑濃度影響較小。由此可知目標分析物濃度可影響基質效應，在測定水產品中除草劑殘留時，應考慮基質效應的影響。

圖6 除草劑質量濃度對基質效應的影響（n=6）Fig.6 Effect of herbicide concentration on matrix effect (n = 6)

2.7.2 不同基質的基質效應

比較同一質量濃度（20 ng/mL）條件下9 種除草劑在對蝦、鯽魚、鯉魚和鳙魚中的基質效應。如圖7所示，基質種類對其基質效應有一定影響，4 種水產品基質中撲草津基質效應在80%～120%之間，滅草松在4 種水產品種存在較強的基質抑制效應（＜60%）。二氯喹啉酸、甲磺隆和芐嘧磺隆在4 種水產品基質中基質效應存在較大差異，在鯉魚和對蝦中均存在較高的基質增強效應（120.90±12.29）%～（170.72±12.38）%；丁草胺、乙草胺、利谷隆、滅草松和莠去津在4 種水產品中均表現為基質抑制效應，因此在測定水產品中除草劑殘留量時應考慮基質效應的影響。

圖7 不同基質的基質效應Fig.7 Matrix effects for different types of matrices

2.7.3 不同基質質量的基質效應

圖8 不同基質質量的基質效應Fig.8 Matrix effects with different matrix masses

采用提取后加標法比較不同基質質量的基質效應，按照上述前處理方法，分別以2.0、5.0 g和10 g樣品，提取凈化后用9 種除草劑混標配制成質量濃度為50 ng/mL基質標樣，采用建立的色譜條件進行測定，分析不同基質質量的基質效應。如圖8所示，在對蝦、鯉魚和鳙魚中，基質質量對基質效應影響較小；2.0 g鯽魚基質中甲磺隆存在較強的基質增強效應，5.0 g和10 g鯽魚基質中9 種除草劑均表現為基質抑制效應。因此為了保證9 種除草劑在水產品中的檢出限和定量限，選擇5.0 g樣品進行殘留測定較為合理。

2.8 實際樣品測定結果

采用建立的方法對廣東省稻魚養殖產地水產品中除草劑殘留進行檢測，共采集鯉魚樣品10 份，其中1 份檢出甲磺隆，含量為2.26 μg/kg；2 份樣品檢出芐嘧磺隆，含量分別為0.71 μg/kg和20.30 μg/kg；6 份樣品檢出丁草胺，含量為7.22 ～24.85 μg/kg；9 份樣品檢出乙草胺，含量為9.39～18.91 μg/kg。

3 結 論

本研究建立水產品中9 種除草劑殘留的QuEChERS結合UPLC-MS/MS檢測方法，樣品經1%甲酸酸化乙腈提取，中性氧化鋁凈化，甲醇-5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）定容后UPLC-MS/MS測定，采用基質標準曲線外標法定量。9 種除草劑在0.50～100 ng/mL之間（二氯喹啉酸和利谷隆1.00～100 ng/mL）范圍內線性良好，相關系數r大于0.99。9 種除草劑檢出限為0.20～0.50 μg/kg，最低定量限為0.50～1.50 μg/kg。4 種水產品基質中其加標回收率和精密度分別為84.33%～116.37%（n=6）和0.80%～13.81%（n=6）。該方法檢出限和定量限較低，加標回收率和精密度較好，且前處理簡單、靈敏度、重復性和準確性較好，適用于水產品中除草劑殘留的定性、定量分析。

采用UPLC-MS/MS聯用法測定水產品中除草劑殘留時，對蝦、鯽魚、鯉魚和鳙魚對9 種除草劑均存在基質效應，且基質種類、基質質量和除草劑質量濃度對基質效應有一定影響。4 種水產品基質中撲草津基質效應在80%～120%，二氯喹啉酸、甲磺隆和芐嘧磺隆在鯉魚和對蝦中均存在較高的基質增強效應；丁草胺、乙草胺、利谷隆、滅草松和莠去津在4 種水產品基質中均表現為基質抑制效應。在實際檢測中，應考慮基質效應對檢測結果的影響，建議在檢測水產品中除草劑殘留時采用基質校準曲線降低基質效應確保檢測結果的準確性。