基于礦質元素和穩定同位素的馬鈴薯產地溯源技術

張欣昕，張福金,，劉廣華，張 堯，王雪嬌，莎 娜，連海飛

（1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010030；2.鄂爾多斯市環境保護中心監測站，內蒙古 鄂爾多斯 017000）

馬鈴薯作為世界十大營養食品之一，可以提供人類生活所必需的基本營養素。它富含淀粉、纖維等碳水化合物和優質蛋白質，并且具有較好的氨基酸組成[1]，幾乎不含游離脂肪和膽固醇[2]，是良好的、廉價的低脂肪食物來源。因此，馬鈴薯又有“能源植物”、“地下蘋果”、“第二面包”等多種美喻[3]。作為內蒙古主要作物之一的馬鈴薯，應其得天獨厚的天然地理環境，具有優于其他產區的品質特征，是內蒙古特色標志性農產品之一。

目前，國內外基于礦質元素和穩定同位素的產地溯源研究眾多：起初多應用于植物源性特色農產品領域，包括葡萄酒[4]、茶葉[5]、水果[6]、小麥[7]、苦蕎[8]、花生[9]、大米[10]、中藥[11]等。例如：Kelly等[12]利用礦質元素溯源分析技術對美國、歐洲、印度和巴基斯坦4 個國家的稻米進行產地鑒別，發現錳、硼、硒、鉛等元素能作為地域特征的重要指紋信息，是有效的溯源指標；Branch等[13]發現δ13C能有效區分加拿大、美國和歐洲不同地域的小麥樣品；馬奕顏[14]探討了礦物元素溯源分析技術在獼猴桃產地溯源的有效性，建立了獼猴桃產地溯源的有效指標體系及產地判別模型；張遴等[15]采用穩定同位素質譜技術，對我國陜西、寧夏、山東等11 個省市‘紅富士’蘋果中δ13C進行測定分析，研究發現‘紅富士’蘋果中δ13C具有區域獨特性和時間穩定性。隨著研究技術的發展，其研究領域逐漸擴展到動物性農產品中，肉類（牛羊肉[16-17]）、乳類制品[18]等領域的產地溯源也有了相當廣泛的研究。例如Schmidt等[19]對美國和歐洲的牛肉樣品中C和N同位素進行研究，結果表明C、N同位素比值可作為區分不同產區牛肉的重要指標。

大量研究表明：基于礦質元素和穩定同位素的溯源分析技術在產地溯源上，溯源指標科學，判別正確率、可信度較高，因此，在借鑒前人完善的采樣方法、檢測技術以及分析手段的基礎上，嘗試利用礦質元素和穩定同位素溯源分析技術，通過對不同產區馬鈴薯礦質元素含量和穩定同位素比值的分析討論，開展馬鈴薯產地判別研究，旨在為內蒙古馬鈴薯產地判別以及地理標志產品保護提供參考與幫助，以期促進內蒙古馬鈴薯區域品牌的構建與發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 mm×5 mm錫囊、濃硝酸（優級純） 德國Meker公司；內標物鈧（Sc）、鍺（Ge）、銦（In）、鉍（Bi）（單元素標準溶液1 000 mg/L） 國家標準物質采購中心；尿素IVA33802174（同位素標準品） 德國Analysentechnik GmbH & Co.KG公司。

1.2 儀器與設備

MARS 6微波消解系統 美國CEM公司；iCAP-TQ電感耦合等離子體質譜儀、DELTA V穩定同位素質譜儀（配Flash EA 1112型元素分析儀） 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

在2017年和2018年馬鈴薯收獲期，分別采集內蒙古、黑龍江、新疆、四川和廣東5 個省區馬鈴薯主產縣市馬鈴薯生產基地樣品，共計100 份，采樣地點信息如表1所示。每個采樣點隨機采集3 個樣品。將采集馬鈴薯去皮后，去離子水洗滌，組織搗碎機勻漿后，取50～100 g，于60 ℃鼓風烘箱干燥2 h后，再用105 ℃烘干至恒質量[20]，充分研磨后，過100 mm目篩，作為分析樣品備用。

表1 采樣地點統計Table 1 Statistics of sampling locations

1.3.2 樣品分析

礦質元素的測定：參考GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》[21]。準確稱取馬鈴薯樣品0.5 g（精確至0.001 g）于微波消解管內，加入10 mL濃硝酸，靜置1 h，旋緊管蓋，采取程序升溫法進行樣品消解，待消解結束后冷卻至室溫，用少量水沖洗內蓋，真空趕酸，用去離子水定容至50 mL容量瓶內，同時做空白實驗。用電感耦合等離子體質譜測定樣品中的鈉、鎂、鋁、鉀、鈣、鐵、硼、磷、釩、鉻、錳、鈷、鎳、銅、鋅、砷、硒、鎘共18 種礦物元素的含量。用外標法定量分析，用環境標樣為標準品，用Sc、Ge、In、Bi保證儀器穩定性。電感耦合等離子體質譜運行條件如表2所示。

表2 電感耦合等離子體質譜運行條件Table 2ICP-MS operating conditions

穩定同位素的測定：參照張協光等[22]的方法。稱取制備好的樣品0.5～1.0 mg包入錫囊，排盡空氣，放入元素分析儀的固體進樣器依次進樣，樣品在960 ℃條件下燃燒生成CO2和N2，經稀釋儀稀釋后進入質譜進行檢測。

元素分析儀測定：氦氣吹掃流量100 mL/min，參考氣流速90 mL/min，氣相柱溫度70 ℃。

質譜條件：真空度6.0×10-6mbar，電離電壓3.0 kV，CO2參考氣壓0.6 bar，N2參考氣壓1.0 bar。

1.4 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對數據進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 基于礦質元素的產地鑒別

2.1.1 礦質元素含量差異分析

表3 不同地區礦質元素含量Table 3 Mineral elements contents in potato samples collected from different producing regions mg/kg

表4 方差分析結果統計Table 4 Analysis of variance

如表3、4所示，砷和硒的P值分別為0.07和0.095 7，在0.05水平上差異不顯著，其他16 種元素含量差異顯著（P＜0.05），說明馬鈴薯中不同礦物元素在不同地區的含量存在顯著性差異。

2.1.2 礦質元素含量主成分分析

表5 礦質元素的主成分貢獻率Table 5 Contribution rates of principal components for mineral elements

主成分分析是一種將多變量通過降維，找出數據群體主要影響因子的多元統計分析方法[23]。如表5所示，選取特征值大于1的成分作為主成分，提取5 個有效主成分。第1主成分貢獻率為33.747%，第2主成分貢獻率為15.243%，第3主成分貢獻率為9.344%，第4主成分貢獻率為6.248%，第5主成分貢獻率為5.973%，總貢獻率達到了70.557%，5 個主成分基本包括了不同元素含量和組成的大部分信息，可充分反映原始數據大量信息。

根據元素的載荷大小逐步對元素進行篩選，參照鹿保鑫[24]的方法。選擇第1主成分和第2主成分的因子載荷值作圖，如圖1A所示，橫坐標代表第1主成分載荷值，縱坐標代表第2主成分載荷值，成分因子載荷值的絕對值取值越大，代表元素的方差貢獻率越大，即硼、磷、錳、鉻、銅、鋅元素載荷值均在0.8左右，在第1主成分上載荷值較大，6 個元素基本可以反映第1主成分的信息；鎂、鈉、鉀、鋁元素載荷值的絕對值在0.6～0.7之間，在第2主成分上載荷值較大，這4 個元素基本可以反映第2主成分的信息，說明硼、磷、錳、鉻、銅、鋅、鎂、鈉、鉀、鋁等元素，攜帶足夠的區域特征信息，在很大程度上可以作為馬鈴薯產地溯源的特征礦質元素。利用第1主成分和第2主成分的因子得分繪制散點圖，如圖1B所示，內蒙古和新疆、四川、廣東、黑龍江5 地樣品基本得到有效區分，內蒙古本地樣品間也存在距離間隔，說明礦質元素可作為馬鈴薯產地鑒別的指標，在內蒙古本地樣品間的產地鑒別上也同樣具有應用的可能性。

圖1 不同地區主成分因子載荷圖（A）和得分圖（B）Fig.1 Loading plot (A) and score plot (B) of PCA for potato samples collected from different producing regions

2.1.3 礦質元素含量判別分析

判別分析是按照一定分類條件，建立判別函數，進行數據樣本分類的統計方法[25]。18 種礦物元素作為分析指標，利用Fisher函數，對不同產地馬鈴薯進行了整體判別。表6分類結果顯示：18 種礦質元素初始的整體判別率為98.4%，廣東和新疆的馬鈴薯樣品100%被正確識別，內蒙古、四川和黑龍江存在錯判樣品，數量分別為1、3 份和2 份，內蒙古、四川和黑龍江產地馬鈴薯樣品判別率分別為99.4%、85.7%和90.0%。

并利用Leave-One-Out Cross Validation交叉驗證對判別結果進行驗證。交叉驗證分組案例中，有94.2%的馬鈴薯樣本被正確分類，其中四川、黑龍江和新疆的馬鈴薯樣本正確判別率分別為71.4%、50.0%和81.8%，低于整體水平。

表6 不同地區礦質元素的判別分析分類結果Table 6 Discriminant analysis of mineral elements in potato samples collected from different producing regions%

在實際產地判別中，不可能同時測定18 種礦質元素，時間成本和經濟成本較高。為了提高實際應用的效率，需要進一步篩選有效信息，減少變量，通過改變變量的處理方式，利用逐步判別對不同地區馬鈴薯樣品進行產地溯源。分析結果顯示，在0.01顯著水平下，有8 種元素進入判別模型，8 種元素分別為鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘，回代檢驗結果顯示8 種元素交叉驗證的正確判別率為89.3%，判別率略低于18 種元素的判別效果，但實際效率相對較高，由鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘8 種元素所建立的判別函數系數如表7所示。

表7 判別式分類函數系數Table 7 Discriminant classification function coefficients

研究發現，主成分分析和判別分析方法都能對內蒙古、新疆、四川、廣東、黑龍江5 地的馬鈴薯樣品進行準確鑒別，2 種方法均證明鈉、鋁、磷、錳和銅元素在馬鈴薯產地溯源中具有良好的產地指紋特征，但判別正確率未達到95%以上。

2.2 基于同位素比值的產地鑒別

2.2.1 同位素比值差異

表8 不同地區δ13C和δ15N值Table 8 δ13C and δ15N values of potato samples collected from different producing regions

如表8所示，不同地區的δ13C值范圍在-22.47‰～-38.55‰之間，δ15N值的范圍在-1.91‰～3.08‰之間，內蒙古與黑龍江、新疆、廣東的δ13C值和δ15N值分別存在顯著性差異（P＜0.05），說明內蒙古馬鈴薯中的δ13C值和δ15N值與其他地區間有明顯的分離趨勢。

研究表明[26]：同一物種的δ13C值差異受生長地的氣候環境（如溫度、海拔、降水等）的影響，而δ15N組成受植物類型、化學肥料、氣候條件、土壤狀況等因素的影響。劉賢趙等[27]研究年降水400 mm等值線上自東北向西南沿途采集的28 個科118 種239 份C3植物樣品，發現所有樣本δ13C與溫度之間呈極顯著線性正相關（P＜0.000 1），隨年均溫度和夏季平均溫度的增加，植物碳同位素均呈偏正的趨勢；李嘉竹等[28]研究發現2 000 m以上高海拔區323 個C3植物樣品δ13C值與海拔高度存在極顯著的線性正相關（r=0.496，P＜0.000 1）；而2 000 m以下低海拔地區C3植物δ13C值與海拔呈負相關，與溫度呈正相關。高登義等[29]也有相似的研究結果。另外，植物的水分利用也是影響δ13C值的關鍵因素，任書杰等[30]研究發現隨水分利用率的下降，δ13C值顯著升高，二者間表現出極顯著負相關。這些研究結果與本實驗的δ13C值和δ15N值在一定程度上具有一致性的規律。

另外，采樣調研顯示：北方的黑龍江和內蒙古馬鈴薯生產均采用規模化噴灌和滴灌方式，灌水充足；南方馬鈴薯生產基本集中在山坡地區，以小農戶生產方式為主，基本不具備灌水設備。新疆的馬鈴薯生產主要集中在農牧交錯帶，農業生產多采用放牧與種植作物混合經營，因此δ15N值較高，這與Suzuki等[31]的研究一致，該研究發現新南威爾士州大米具有更高δ15N值（9.0‰），明顯區別于加利福尼亞（3.2‰）和日本大米（0.4‰～6.1‰）。

因此，以δ13C值為橫坐標，δ15N值為縱坐標作二維投射圖，如圖2所示，內蒙古樣品與黑龍江、新疆、廣東和四川樣品基本可以成功區分，說明這5 地的δ13C值和δ15N值的組成差異較大，與方差分析結果一致。

圖2 不同地區的δ13C值和δ15N值Fig.2 δ13C versus δ15N plot for potato samples collected fromdifferent producing regions

2.2.2 同位素比值的聚類分析

聚類分析是將數據中具有相似性的數據進行歸類劃分的統計方法[32]。對不同地區樣品中的δ13C值和δ15N值進行聚類分析，采用Ward聚類方法計算歐氏距離，產生聚類分析樹狀圖，結果如圖3所示。以最小分類級別（1.7）為分割線，所有樣品可以分為10 類，其中內蒙古與黑龍江、新疆和廣東距離較遠，被完全分離，其δ13C值和δ15N值的組成差異較大，內蒙古與四川樣品存在交叉現象、黑龍江和新疆樣品存在交叉現象。同時也發現，內蒙古本地區樣品也被劃分為5 類，內蒙古不同地區在其δ13C值和δ15N值的組成上也存在較大差異，證明了δ13C值和δ15N值的組成也可應用于內蒙古不同馬鈴薯產地的鑒別研究。

圖3 不同地區的δ13C值和δ15N值聚類分析Fig.3 Cluster analysis of potato samples collected from different producing regions based on δ13C and δ15N

2.2.3 同位素比值的判別分析

為了將δ13C值和δ15N值轉化為可通過函數計算，并能獲得產地判別精度，再一次應用判別分析的方法對不同地區的δ13C值和δ15N值進行分析。利用Fisher函數，獲得5 個判別函數，利用判別函數進行不同產地樣品判別，如表9所示。初始判別率為82.0%，其中內蒙古和黑龍江的產地初始判別準確率分別為82.6%和77.8%，低于平均水平，可能需要利用礦質元素的指紋特性進一步提升產地鑒別的精度。

表9 不同地區判別分析分類結果Table 9 Discriminant analysis of potato samples collected from different producing regions based on δ13C and δ15N%

2.3 基于礦質元素和同位素比值的產地判別

針對8 種礦質元素含量和同位素比值分別在產地判別正確率均未達到95%以上的問題，進一步研究2 種方法相結合的產地判別方法。

基于鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘、δ13C和δ15N值，再次對內蒙古與黑龍江、新疆、四川和廣東不同產地馬鈴薯進行產地判別，結果如表10所示。在礦質元素含量和同位素比值綜合指標下，對初始分組案例中94.7%進行正確分類，即不同產地的初始判別正確率為94.7%，對交叉驗證分組案例中93.2%進行了正確分類，即不同產地的交叉驗證正確率達93.2%，高于礦質元素含量和同位素比值單獨判別正確率，判別結果良好。

表10 基于礦質元素和穩定同位素的不同地區判別分析分類結果Table 10 Discriminant analysis of potato samples collected from different producing regions based on mineral elements and stable isotopes%

3 結 論

本研究分別對內蒙古與黑龍江、新疆、四川和廣東不同產地馬鈴薯樣品進行礦質元素含量和組成、碳和氮同位素比值進行測定。采用步進式方法篩選出鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘8 種礦質指紋指標，回代檢驗結果顯示這8 種元素的交叉驗證的正確判別率為89.3%；不同地區的δ13C值和δ15N值存在顯著性差異，內蒙古樣品與黑龍江、新疆、廣東樣品基本可以成功區分，采用δ13C和δ15N建立的產地判別模型的判別正確率為82.0%；在鈉、鋁、磷、錳、鈷、鎳、銅、鎘、δ13C和δ15N的綜合指標下，不同產地的初始判別正確率達94.7%，不同產地的交叉驗證正確率達93.2%，高于礦質元素含量和同位素比值單獨判別正確率，判別結果良好。結果證明利用礦物元素和穩定同位素相結合的技術可以對馬鈴薯進行有效的產地判別，判別正確率較高，是產地溯源的有效方法。