二維超高效液相色譜-三重四極桿/復合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法快速測定水產(chǎn)品及其制品中河豚毒素

張秀堯，蔡欣欣，張曉藝，李瑞芬

（溫州市疾病預防控制中心，浙江 溫州 325001）

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種毒性很強的非蛋白神經(jīng)毒素，存在于河豚魚和多種脊椎動物及無脊椎動物體內(nèi)，如河豚魚、織紋螺、蠑螈、蟾蜍和蟹類等水產(chǎn)品。TTX屬氨基全氫化喹唑啉化合物，為鈉通道阻斷劑，可以選擇性地阻斷神經(jīng)元細胞及肌膜上的鈉離子通道，阻斷神經(jīng)沖動的傳導，引起神經(jīng)麻痹，嚴重者抑制呼吸導致死亡[1-2]。TTX的化學性質(zhì)穩(wěn)定，烹飪、日光曝曬、鹽腌等一般食物加工方法均難以完全破壞，所以含有TTX的水產(chǎn)品加工成制品，如烤魚片或魚干等也是有毒的。由于河豚魚和織紋螺等肉鮮味美，我國沿海均有食用的習慣，已發(fā)生多起誤食河豚魚或織紋螺等引起的TTX中毒事件[3-6]，中毒后又缺乏特效解毒藥，嚴重者常致人死亡，TTX中毒已成為引人關(guān)注的水產(chǎn)品安全問題。因此，水產(chǎn)品及其制品中TTX的檢測方法一直是研究的熱點。

水產(chǎn)品中TTX的檢測方法主要有小鼠生物法[7-8]、液相色譜紫外檢測法[9]、液相色譜柱后衍生熒光法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[12-20]等。其中小鼠生物法測定樣品的總毒性，但不能對樣品中毒素成分進行定性，且小鼠個體差異較大，檢測結(jié)果誤差大；液相色譜紫外檢測法選擇性差、靈敏度低；液相色譜熒光檢測法選擇性不強，常有基質(zhì)成分的干擾；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要衍生，操作比較復雜，測定在強堿性條件下能夠生成C9-堿的包括TTX在內(nèi)的TTX類似物的總和，且靈敏度低；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高、定性能力強，是測定TTX的理想檢測方法。早期由于缺少TTX專一性強的樣品前處理方法，樣品處理液的基質(zhì)抑制效應比較嚴重，又沒有商品化的同位素內(nèi)標，多使用基質(zhì)匹配標準外標法定量，方法的靈敏度不高，定量的準確度和精密度均不理想[13-15]。近年來有文獻采用免疫親和柱凈化方法，能夠去除雜質(zhì)，消除基質(zhì)效應（matrix effect，ME），可以采用溶劑標準法進行定量，但也存在免疫親和柱價格高、線性范圍窄等缺點[16-18]。

二維超高效液相色譜技術(shù)具有峰容量大、分離能力強、能夠顯著降低復雜樣品的ME、實現(xiàn)樣品分析的自動化等優(yōu)點，已在食品安全、中藥有效成分分析、環(huán)境科學等領域得到廣泛應用[21-23]。本研究采用中心切割二維超高效液相色譜技術(shù)同時對樣品進行凈化和分離，減少樣品ME，采用三重四極桿/復合線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)進行檢測，建立水產(chǎn)品及其制品中TTX的快速檢測方法，方法簡單、靈敏、準確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（液相色譜溶劑級） 德國Merck公司；乙酸、甲酸（液相色譜溶劑級） 美國Tedia公司；TTX標準物質(zhì)（純度≥99%） 大連瑞芳生化物品有限公司，用0.2%乙酸溶液配制成100 μg/mL標準貯備溶液，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 儀器與設備

二維超高效液相色譜儀（由ACQUITY UPLC QSM四元溶劑管理系統(tǒng)（第1維）、ACQUITY UPLC BSM二元溶劑管理系統(tǒng)（第2維）、ACQUITY UPLC FTN樣品管理系統(tǒng)、ACQUITY UPLC CM-A色譜柱管理系統(tǒng)和515稀釋泵組成，由Empower 3工作站控制） 美國Waters公司；QTRAP 6500三重四極桿/復合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀（由Analyst 1.6.2軟件控制） 美國AB SCIEX公司；GM200碾磨儀德國Retsch公司；ULTRA-TURRAX T-25型分散機、MS3旋渦混旋器 德國IKA-WERKE公司；3-30K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；2510超聲波清洗機美國Branson公司；Gradient A10 Mill-Q超純水器 法國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

從樣品中取出有代表性的可食部分經(jīng)碾磨儀攪碎、均質(zhì)，-35 ℃冷凍保存。

稱取2.00 g樣品置于50 mL具塞離心管中，加入9.0 ml 0.2%乙酸溶液，分散機勻質(zhì)15 s，刀頭用9 mL 0.2%乙酸溶液清洗，提取液調(diào)pH 3～5，置于沸水浴中加熱5 min，（或者102 ℃烘箱放置10 min），取下用冷水冷卻至室溫，超聲提取5 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，殘渣再用刀頭清洗液重復提取1 次，合并提取液，用0.2%乙酸溶液定容至20 mL，混勻，吸取100 μL提取液加入900 μL 0.2%乙酸溶液，旋渦混勻，過0.2 μm濾膜，待測。

1.3.2 色譜條件

中心切割二維超高效液相色譜流路圖見圖1。

圖1 中心切割二維超高效液相色譜流路圖Fig.1 Schematic illustration of heart-cutting two-dimensional liquid chromatography

第1維：保護柱Hypercarb PGC（4.6 mm×10 mm，5 μm，色譜柱1），色譜柱為Hypercarb PGC（2.1 mm×100 mm，3 μm，色譜柱2），柱溫40 ℃，流動相A：0.2%甲酸溶液，流動相B：乙腈；進樣體積10 μL。515稀釋泵的溶劑為乙腈。梯度洗脫程序見表1。

第2維：捕集柱為XBridge BEH Amide guard column（4.6 mm×10 mm，2.5 μm，色譜柱3），分析柱為Acquity BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，色譜柱4）柱溫40 ℃，流動相A：0.1%甲酸-乙腈溶液，流動相B：0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描方式，多離子監(jiān)測觸發(fā)的增強子離子掃描（multiple reaction monitoringinformation dependent acquisition-enhanced product ion scanning，MRM-IDA-EPI）模式。離子化電壓：5 500 V，離子源溫度：600 ℃，氣簾氣壓強：276 kPa，噴霧氣壓強：345 kPa，輔助加熱氣壓強：414 kPa，碰撞器：High。TTX的定量離子對為m/z320.0/302.2，定性離子對為m/z320.0/162.2，去簇電壓均為150 V，碰撞能量分別為32 eV和50 eV。增強子離子掃描參數(shù)：掃描速率10 000 Da/s，掃描范圍m/z100～340，動態(tài)阱集時間不大于1 ms，增強子離子掃描碰撞能量：30、40 eV和50 eV。

運行開始時，第2維色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液，6.00 min后再切換至離子源，質(zhì)譜開始采集數(shù)據(jù)直到7.00 min結(jié)束，同時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件選擇

在電噴霧正離子檢測方式下對質(zhì)譜測定條件進行優(yōu)化，Q1掃描時可見[M＋H]＋峰，然后對準分子離子峰進行碰撞，通過子離子掃描得到TTX碎片離子信息，然后再對去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，使得分子離子對的信號達到最強，選擇兩對分子離子對，以響應相對較強的子離子作為定量離子，另一子離子作為定性離子。同時設定合適的峰駐留時間確保色譜峰的采樣點數(shù)在15～20點，從而得到較好的定量重復性。優(yōu)化后的測定條件見1.3.3節(jié)。

三重四極桿/復合線性離子阱質(zhì)譜，既保留三重四極桿質(zhì)譜較好的選擇性與靈敏度，又增加了線性離子阱增強子離子掃描功能，采用電噴霧正離子模式MRM-IDAEPI模式，一次進樣可以同時得到用于定量的MRM色譜圖和用于定性的增強子離子掃描質(zhì)譜圖，利用標準物質(zhì)自建增強子離子掃描譜庫，檢測時可以通過譜庫檢索技術(shù)對被檢出化合物進行確證，提高了方法的定性能力，有利于復雜基體中痕量目標化合物的定性，可以避免假陽性結(jié)果。圖2為含有0.008 mg/kg TTX的織紋螺樣品的增強子離子掃描譜圖，譜庫檢索的TTX符合率為92.2%。

圖2 織紋螺中TTX的增強子離子掃描譜圖Fig.2 Enhanced product ion scan spectra of tetrodotoxin in Nassarius

2.2 中心切割二維色譜條件的選擇與優(yōu)化

TTX屬強極性化合物，在常規(guī)反相色譜柱上不保留或保留很弱，目前多采用酰胺型親水色譜柱進行分離[14,16-18,24-27]，實驗選用Acquity UPLC BEH Amide色譜柱作為第2維色譜柱進行分離。采用親水色譜法進行分離時，TTX易受基質(zhì)成分影響，表現(xiàn)為保留時間不穩(wěn)定，基質(zhì)抑制效應較嚴重[14]。為了去除基質(zhì)成分增加了一維分離，采用Acquity UPLC HSS T3、Agilent Zorbax SB-Aq和Thermo Fisher Hypercarb色譜柱作為第1維分離柱，結(jié)果顯示只有Hypercarb色譜柱能夠較好保留TTX，以0.2%甲酸溶液作為流動相時TTX的保留時間為2.68 min（保留因子約為0.5）（圖3），因此選擇Hypercarb色譜柱作為第1維分離柱，采用中心切割的方式去除基質(zhì)雜質(zhì)，既可減少ME，又可確保第2維分離TTX時保留時間穩(wěn)定。為了確保TTX切割完全，增加方法的耐受性，適當加大切割時間的區(qū)間，經(jīng)過實驗中心切割時間最終確定為2.20～3.20 min。若單純采用Hypercarb色譜柱進行TTX的分離，由于保留不強，易受基質(zhì)成分影響，質(zhì)譜信號抑制明顯，將第1維色譜柱流出的含有TTX的流分通過六通閥切換至捕集柱（XBridge BEH Amide guard column），Amide柱保留TTX的機理為親水色譜分離機理，由于此時第1維流動相0.2%甲酸溶液為Amide柱的強洗脫流動相，TTX不能被Amide柱保留，必須泵入高比例的乙腈（弱洗脫流動相），TTX才能被Amide柱保留，因此選擇515泵泵入高比例的乙腈通過三通先與第1維色譜柱切割的流分混合后，再流入Amide捕集柱，TTX就可被捕集在捕集柱的柱上，實驗分別以0.50、1.00、2.00、3.00 mL/min泵入乙腈，結(jié)果顯示當乙腈流速不低于2.00 mL/min時，TTX可被Amide完全捕集在柱頭，洗脫出來的色譜峰窄而高，故后續(xù)實驗乙腈流速選用2.00 mL/min。當TTX捕集完成后，六通閥將捕集柱反向切入第2維色譜系統(tǒng)，流動相將捕集在柱頭的TTX洗脫入Amide分析柱中進行分離，此時TTX得到聚焦，洗脫色譜峰比較窄，檢測靈敏度高，保留時間穩(wěn)定，見圖4。優(yōu)化二維色譜條件見1.3.2節(jié)。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫條件及閥切換時間Table 1 UPLC gradient elution conditions and valve switching program

圖3 第1維液相分離MRM色譜圖Fig.3 First-dimensional MRM chromatograms

圖4 TTX二維超高效色譜MRM圖Fig.4 MRM chromatograms of TTX (1.0 μg/L) by two-dimensional UPLC

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

TTX不溶于水和一般有機溶劑，但在酸性條件下，可溶于水和甲醇。目前文獻報道的提取方法主要有酸性水溶液和酸性甲醇溶液，考慮到提取效率以及提取液與第1維色譜柱分離條件的匹配性，選擇0.2%乙酸溶液作為提取劑進行2 次提取，TTX提取效率可達98%以上[14,28]。

水產(chǎn)品中TTX凈化方法主要有：反相固相萃取結(jié)合超濾法[10]、石墨化碳黑固相萃取法[14]和免疫親和柱凈化法[16-18]等。反相固相萃取結(jié)合超濾法凈化效果不好，ME非常嚴重；石墨化碳黑固相萃取法凈化后，水產(chǎn)品中TTX的基質(zhì)抑制效應在40%～50%左右，定量時要采用基質(zhì)標準進行匹配，在實際樣品測定時，當一批樣品由多個不同類型樣本組成時，采用基質(zhì)標準匹配時工作量大；免疫親和柱凈化效果好，水產(chǎn)品中TTX基本不呈基質(zhì)抑制效應，可以采用溶劑標準定量，但免疫親和柱價格高，易受柱容量等因素限制，線性范圍比較窄[16-18]。

本法采用中心切割二維色譜法進行凈化和分離，在第1維Hypercarb色譜柱分離時可將TTX與大部分基質(zhì)成分分離，中心切割時只將含有TTX的流分切入第2維的色譜柱進行分離，由于本法兩維的分離機理分別為反相色譜和親水色譜，具有一定的正交性，第1維切割的TTX流分中含有的基質(zhì)成分在第2維色譜柱上與TTX得到較好地分離，經(jīng)過實驗將樣品提取液再稀釋10 倍后進行測定，基質(zhì)抑制效應很小。選取貽貝、花蛤、香螺、織紋螺和河豚魚肉進行ME評估，在樣品提取液中加入適量的標準溶液制成基質(zhì)匹配標準溶液系列（0.02～20 μg/L）進行測定，將基質(zhì)匹配標準曲線的斜率除以溶劑標準曲線（0.02～20 μg/L）的斜率再乘以100%作為樣品的ME[29]，當ME＜100%，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應，當ME＞100%，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，當ME=100%，表現(xiàn)為無ME，結(jié)果見表2，樣品的ME在88%～95%之間，表明不存在明顯的ME，可以采用溶劑標準外標法定量[30]，因此無需進行基質(zhì)匹配，方便操作，又能得到準確結(jié)果。

表2 水產(chǎn)品中TTX的METable 2 Matrix effects of TTX in aquatic products

2.4 方法的分析性能

2.4.1 標準曲線、檢出限和定量限

將TTX標準品溶液用0.2%乙酸溶液稀釋成分別含0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、10 μg/L和20 μg/L的TTX系列標準溶液進行測定，采用MultiQuant（Ver.3.0）定量軟件進行數(shù)據(jù)處理，以定量離子對的峰面積（y）對標準系列質(zhì)量濃度（x，μg/L）進行回歸（權(quán)重取1/x），TTX在0.02～20 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)回歸方程為y=1.18×106x＋8 582，相關(guān)系數(shù)優(yōu)于0.999，符合線性關(guān)系的要求。

在空白樣本中加入系列低質(zhì)量濃度的TTX按本法測定，以兩對分子離子對的RSN≥3時對應的樣品質(zhì)量濃度作為檢出限，RSN≥10時對應的樣品質(zhì)量濃度作為定量限，實驗測得樣品的檢出限為0.000 7 mg/kg，定量限為0.002 mg/kg，定量上限為2.0 mg/kg，高質(zhì)量濃度樣品需稀釋后再行測定。

2.4.2 方法的精密度和加標回收實驗

表3 水產(chǎn)品中TTX加標回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of tetrodotoxin in aquatic products (n= 6)

選取不含TTX或含低含量TTX的貽貝、花蛤、香螺、織紋螺、河豚魚肉和烤魚片進行加標回收和精密度實驗，樣品中添加了不同質(zhì)量濃度的標準溶液后，放置過夜，使待測成分與樣品基體成分相互作用達到平衡，再按樣品前處理方法進行操作，其回收率和精密度結(jié)果見表3。樣品的加標回收率分別為82.3%～95.4%，相對標準偏差在2.1%～14%之間，符合痕量分析的要求。

2.5 實際樣品的分析

采用本法在4 a時間內(nèi)共測定291 份水產(chǎn)品及其制品。貽貝、花蚶、牡蠣、扇貝、花蛤、文蛤等80 份貝類樣品中有1 份白蛤和2 份文蛤檢出TTX，含量分別為0.022、0.008 mg/kg和0.007 mg/kg；40 份香螺均檢出TTX，含量為0.002～0.296 mg/kg；118 份烤魚片中有26 份檢出TTX，含量為0.002～2.55 mg/kg；53 份織紋螺均檢出TTX，含量為0.003～64.1 mg/kg，其中有10 份織紋螺中TTX的含量在7.9～64.1 mg/kg之間，存在中毒隱患。

3 結(jié) 論

本研究建立了中心切割二維超高效液相色譜-三重四極桿/復合線性離子阱質(zhì)譜法快速測定水產(chǎn)品及其制品中TTX的方法。通過二維色譜分離系統(tǒng)的優(yōu)化，達到較好的樣品凈化和分離效果，基本消除了樣品ME，簡化了樣品前處理操作，簡便快速；通過對質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化，得到了較高的檢測靈敏度；采用MRM-IDA-EPI模式，一次進樣可以同時得到用于定量的MRM色譜圖和用于定性的二級掃描質(zhì)譜圖，提高了定性能力，有利于復雜基體中痕量目標化合物的定性；采用溶劑標準外標定量，結(jié)果準確、重復性好，已應用于實際樣品的測定取得滿意結(jié)果。