氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜法輔助鑒定醬油未知的氣味活性化合物

馮云子，周 婷，蔡 宇，陳子杰，趙謀明,

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641；2.賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海 201206）

在食品的眾多揮發性化合物中，僅有一小部分的物質賦予食品特殊的香氣屬性，并在食品特征香氣呈現中起主要作用，具有這類性質的揮發性組分，被稱之為氣味活性化合物[1-2]。現階段，氣味活性化合物的研究多采用氣相色譜-質譜-嗅聞（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）聯用技術，即利用分流口，將經GC毛細管柱分離后得到的組分分流到檢測器（MS）以及嗅探口，同時完成質譜碎片的信息收集及香氣特征的嗅辨，然后通過比對譜庫信息、標準品的質譜、保留指數和香氣特征等，鑒定樣品的關鍵氣味活性化合物。這些技術的應用使得大量的氣味活性化合物被鑒定出來，迄今為止，已有約300 種[3]。

目前與嗅聞儀聯用的質譜技術多以單位質量分辨率的四極桿質譜為主，由于儀器檢測限及分辨率不足的原因，往往存在一些香氣活性區域無法準確定性的現象，可能的原因是待測物質含量低于四極桿質譜檢出限，或和其他物質在色譜上共流出而無法有效分離等，從而造成食品中香氣活性物質的分離常有“未知物質”的存在。本團隊前期圍繞醬油氣味活性化合物做了大量工作，從高鹽稀態醬油和日式醬油中分別嗅聞到61 個和39 個香氣活性區域，但共有3 個香氣區域無法鑒定，分別表現出“堅果香”和“甜香”等[4-5]。Steinhaus等[6]在醬油中檢測出15 個稀釋因子大于8的香氣活性區域，其中也有2 個“焦糖香”的香氣活性物質未定性。香氣的閾值為10-4～10-9不等，因此，以高含量存在的揮發性化合物不一定具有香氣貢獻，同理，痕量濃度的一些揮發性化合物可能具有強烈的香氣活性[7]，如食品中的含硫化合物、酯類化合物等。這一類“未知”氣味活性化合物的分析是近年來食品風味行業亟待解決的難題。

低分辨質譜（low resolution mass spectrometry，LRMS）儀面對實際復雜基質的樣品時，定性、定量分析能力受限于質量分析器本身。與GC技術廣泛聯用的高分辨質譜包括扇形磁式質譜儀、飛行時間質譜儀和靜電場軌道阱質譜（orbitrap-mass spectrometry，Orbitrap-MS）儀。其中磁質譜受限于磁場掃描速度，不適用于全掃描的定性分析，而飛行時間質譜局限于本身的分辨率、靈敏度和線性范圍，二者都不是完美的質量分析器[8]。自2005年Alexander Makarov發明的Orbitrap-MS技術首次被商用后，涌現出大量關于蛋白質組學、液相色譜聯用的研究，展現了這一近乎完美的質譜新技術在化合物定性、定量分析上的巨大優勢[9]。2015年，首款與GC聯用的Orbitrap-MS問世，分辨率高達120 000（m/z200，FWHM）、質量偏差小于1×10-6、靈敏度高至ng/L水平，為GC-MS技術的深度和廣度推進提供了更多可能[10]。GC-Orbitrap-MS目前已被廣泛應用于檢測食品中農藥殘留[11]、環境中揮發性化合物和持久性有機污染物[12]、包材中可溶出物與可萃取物[13]、尿液中興奮劑與禁用藥物[14]、代謝組學[15]等。然而，用于食品風味成分分析鮮見報道。

本實驗以醬油為例，通過固相微萃取提取、富集香氣化合物，運用GC-Orbitrap-MS，輔助氣相色譜-單四極桿質譜-嗅聞（gas chromatography-quadruple-mass spectrometry-olfactometry，GC-Q-MS-O）聯用法鑒定“未知”氣味活性化合物，該法與傳統GC-MS-O相比，能更全面、準確地鑒定食品中的氣味活性化合物，有利于食品香氣重構模型的建立，對食品風味的研究有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業醬油市購，采用高鹽稀態發酵工藝，樣品存儲在原始容器中，并貯藏于4 ℃。

苯乙醛（95%）、3-甲基丁酸（99%）、3-甲硫基丙醛（98%）、4-乙烯基愈創木酚（≥98%）、愈創木酚（99%）、異丁酸乙酯（99%）、3-羥基-2-甲基-4-吡喃酮（麥芽酚，99%）、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮（2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone，HDMF，≥99%）、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（5-ethyl-4-hydroxy-2-methyl-3(2H)-furanone，HEMF，異構體混合物，96%）、2-甲基-3庚酮（99%，內標）、正構烷烴標準品（C6～C33，99%） Sigma（上海）有限公司；4-乙基苯酚 Fluka（上海）有限公司；3-甲基-1-丁醇（99.8%）、丁酸乙酯（≥99.5%）、1-辛烯-3-醇（98%）、2-甲基丁酸（98%）、4-乙基愈創木酚（98%）、2-苯基乙醇（98%）、二甲基三硫化物（98%）、3-甲硫基丙醇（99%）、異佛爾酮（97%）、2,5-二甲基吡嗪（98%） Aladdin（上海）有限公司；二氯甲烷（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；無水硫酸鈉（分析純） 江蘇強盛功能化學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Trace 1310氣相色譜儀、ISQ II四極桿質譜儀、TriPlus RSH自動進樣器、TR-5ms彈性石英毛細管色譜（60 m×0.25 mm，0.25 μm）柱、Q Exactive靜電場軌道阱高分辨質譜、TraceGOLD TG-5SilMS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Thermo Fisher Scientific公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；ODO II嗅聞儀 澳大利亞SGE公司；EL 204/EL 3002電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；HHW-21CO-6W型電熱恒溫水浴鍋 上海福瑪實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取

采用前期優化好的固相微萃取方法[16]。將8 mL醬油樣品加入20 mL頂空進樣瓶中，加入20 μL內標（1.724 mg/L的2-甲基-3-庚酮-甲醇溶液），將氯化鈉質量濃度調整至270 g/L，并用PTFE-silicone瓶蓋密封。在45 ℃保溫平衡20 min后，插入75 μm CAR/PDMS萃取頭，并在45 ℃振蕩萃取30 min。萃取后，在GC進樣口（250 ℃）解吸3 min。萃取頭首次使用時，需在270 ℃老化30 min；連續進樣時，2 個樣品之間萃取頭需要在270 ℃老化10 min，以防止樣品之間的相互污染。

1.3.2 GC-Orbitrap-MS檢測條件

使用配備TriPlus RSH自動進樣器和TRACE 1310氣相色譜儀的Q Exactive GC-Orbitrap-MS進行分析。TraceGOLD TG-5SilMS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至130 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min，分流比20∶1，傳輸線溫度250 ℃。質譜分辨率60 000（m/z200，FWHM），在電噴霧離子源（電子能量70 eV）下獲得質譜，質量掃描范圍m/z33～350 ，離子源溫度280 ℃。

1.3.3 GC-LRMS檢測條件

配備TriPlus RSH自動進樣器和TRACE 1310氣相色譜儀的四極桿GC-MS系統進行GC-MS和GC-O分析。TR-5MS毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min，分流比10∶1，傳輸線溫度250 ℃。電子電離源，電子能量70 eV，質量掃描范圍m/z33～350，離子源溫度280 ℃。

1.3.4 GC-Q-MS-O檢測條件

GC-MS檢測條件同1.3.2節。GC-O實驗中，色譜流出物以1∶1的分流模式分別流入質譜與嗅聞裝置中，嗅聞儀輸出端管線加熱至280 ℃以防止流出物冷凝，并輔以水蒸氣以避免人鼻黏膜脫水損害嗅覺靈敏度。

GC-O實驗由5 名感官人員進行（2 名男性和3 名女性，年齡19～31 歲）。對感官人員進行2 次培訓，一次利用香氣單體標準品進行嗅聞培訓，以增強感官人員對香氣的印象及規范感官人員對香氣特征的描述；一次對醬油香氣樣品進行GC-O實驗，以適應GC-O分析程序及香氣強度的判定（1=微弱的，可識別的味道；2=清晰，但不強烈的味道；3=強烈的味道；4=極其強烈的味道）。正式實驗中每人重復嗅聞2 次，每次嗅聞時間約為30 min。感官評價人員在嗅聞過程中描述香氣化合物的氣味特征及強度。記錄系統配備錄音功能以記錄感官人員的氣味描述和評定的氣味強度。

1.4 數據處理

GC-MS數據采用Xcalibur 2.0版（Thermo Finnigan）軟件將質譜圖與NIST 2017比對分析；GC-Orbitrap-MS數據采用Thermo Scientific TraceFinder（version 4.1）進行處理，對數據進行解卷積后再將質譜圖與NIST 2017比對。通過譜庫比對的正/反向匹配度和保留指數（retention index，RI），共同確證未知化合物的定性結果，高分辨質譜數據輔助以高分辨過濾分值和質量偏差判斷定性結果。RI以C6～C33的系列正構烷烴在相同實驗條件下計算得到。高分辨數據的元素組成推斷由Thermo Scientific Qual Browser軟件完成，質量精度小于3×10-6。

2 結果與分析

2.1 基于GC-Q-MS與GC-Orbitrap-MS測定醬油揮發性化合物的分類對比

圖1 采用GC-Q-MS和GC-Orbitrap-MS檢測醬油中揮發性化合物數量的對比Fig.1 Comparison of the numbers of volatile compounds detected in soy sauce by using GC-Q-MS and GC-Orbitrap-MS

如圖1所示，通過GC-Q-MS與GC-Orbitrap-MS分別從醬油樣品中鑒定出91 種和166 種揮發性化合物，其中GC-Orbitrap-MS對呋喃（酮）類、含硫化合物、雜環類以及酯類的檢測數量都明顯高于GC-Q-MS，分別比GC-Q-MS檢出數量多15、10、8、8 個化合物；且GC-Orbitrap-MS檢出化合物的總峰面積為GC-Q-MS總峰面積的31.1 倍。兩者的差異可能是由于樣品中這幾大類化合物含量較低，但GC-Q-MS的檢出限相對較高而無法定性分析引起，然而低含量并不影響其為食品貢獻香氣，因為往往這類物質香氣閾值非常低[17-18]。如Song Xuebao等[19]發現苯甲硫醇和2-甲基-3-呋喃甲醇的閾值分別為0.01 μg/L和5.7×10-3μg/L，它們在白酒中的含量非常低，但仍顯示出高于100的氣味活性值，對白酒的整體香氣有顯著貢獻。綜上所述，GC-Orbitrap-MS高分辨數據容量大、靈敏度高的特點，使其在痕量低閾值物質的檢出方面具有明顯的優勢，適合于未知氣味活性化合物的挖掘。

2.2 GC-Q-MS-O分析醬油的氣味活性化合物的難點

采用GC-Q-MS-O鑒定醬油的香氣活性物質，并基于本團隊多年醬油香氣分析的經驗，經過內部醬油香氣譜庫對比分析，最終仍有4 個強香氣活性區域無法確定，RI如表1所示。未知物質1的RI為760，其前后分別檢出2-甲基丙酸和甲苯，均與果香不相符，推測可能為酯類物質；RI為796的附近檢出2-甲基-3-己酮、2,3-丁二醇，相關報道[4]中也在此處聞見“果香”，被鑒定為2,3-丁二醇，然而在進一步研究發現2,3-丁二醇的閾值較高，為150 mg/L，計算其氣味活性值（發現并不相符，可能鑒定錯誤，因此RI為796標記為未知物質2。未知物質3（RI為829）前后分別檢出甲基吡嗪、糠醛、3-甲基丁酸，均與“清香，草香”香氣描述不相符。未知物質4（RI為1 119）被描述為“花果香”，此處附近檢出苯乙醇、HEMF，苯乙醇峰面積較大，然而此處香氣描述并不完全同于苯乙醇標準品的“花香”[20-21]，推測是2 個香氣物質共流出導致，因此除了苯乙醇檢出外，標記未知物質4。

表1 醬油中4 個“未知”香氣活性區域的RI及香氣特征Table 1 Retention indices and aroma characteristics of 4 “unknown”aroma-active compounds in soy sauce

2.3 GC-Orbitrap-MS輔助GC-Q-MS-O鑒定醬油的未知香氣化合物

采用GC-Orbitrap-MS分析嗅聞樣品，在未知物質RI附近進行重點分析，與GC-MS分析物質對比結果如表2所示，4 個目標“未知物質”的雙質譜（GC-Q-MS和GCOrbitrap-MS）選擇離子流圖如圖2所示。結果均表明GCOrbitrap-MS在關鍵香氣活性區域附近相對GC-MS，均有新的物質檢出。

表2 基于GC-Q-MS和GC-Orbitrap-MS譜圖“未知”氣味活性化合物分析Table 2 Analysis of four “unknown”aroma-active compounds by GC-Q-MS and GC-Orbitrap-MS

由表2可知，RI在760±10范圍內，GC-Q-MS檢出2 個物質，但GC-Orbitrap-MS檢出3 個物質，其中新檢出物質為異丁酸乙酯，符合RI和嗅聞結果，即該區域有“水果香”的香氣特征[22-23]，且該酯類物質閾值非常低，僅為2.2×10-2μg/L[24]，因此在極低質量濃度也具有香氣貢獻，故GC-MS-O結果中未知物質1有很大可能是異丁酸乙酯。如圖2a可知，根據GC-Orbitrap-MS鑒定結果，確定目標物質具有m/z88.051 9的特征碎片，然后在GC-MS譜圖中提取同一碎片峰m/z88，放大譜圖發現該峰處于2-甲基丙酸的峰尾覆蓋處，質譜碎片交叉較多，難以分析解譜。由圖2a可以明顯發現，GC-MS與GC-Orbitrap-MS采用同一碎片提取，峰形顯著改善，信噪比從89提高到3 993；隨著進一步在Mass Tolerance 5 ppm模式下提取高分辨譜圖離子信息，信噪比得到進一步的提升，達到5 541，表明高分辨質譜通過分辨率可以實現選擇離子流圖的低噪聲，同樣的樣品在高分辨下可以獲得更高的信噪比，更有助于未知香氣物質的解析。

在RI為796處（未知物質2）其“水果香”風味特征與未知物質1（異丁酸乙酯）類似，GC-Orbitrap-MS數據表明，在該RI附近解析出3 個新物質，分別為2,4-二甲基-3-戊酮、2-乙基-5-甲基呋喃、丁酸乙酯（表2），其中丁酸乙酯RI和香氣特征最為相符，文獻風味描述為“水果味”、“酯味”[25-26]。

在RI為829±10范圍內，未知物質3具有“青草，清香”的風味特征，GC-Orbitrap-MS在該區域比GC-Q-MS多檢出1 個物質，為3-己烯-2-酮。Culleré等[27]在藏紅花中曾檢出3-己烯-2-酮，其氣味描述詞為“青草香”、“天竺葵”。

RI為1 119附近（未知物質4）被感官人員描述為“花果香”，GC-Orbitrap-MS除檢出苯乙醇和HEMF外，還檢測出1 個新物質——異佛爾酮。在之前的研究中異佛爾酮曾被描述為“果香”、“青草香”[28-29]，閾值為0.22 mg/L[30]，苯乙醇則具有“花香、甜香”的香氣特征，且在GC-MS譜圖提取異佛爾酮特征碎片m/z82后，發現為m/z82的色譜峰在苯乙醇高峰掩蓋之下（圖2d），因此花果香的描述很可能由于苯乙醇與異佛爾酮的共流出造成。

圖2 未知香氣物質的雙質譜（GC-Q-MS和GC-Orbitrap-MS）聯合解析Fig.2 Analysis of four unknown odorants by combined use of GC-QMS and GC-Orbitrap-MS

GC-Q-MS在定性分析，主要依賴于與NIST譜庫比對的結果（正/反向匹配度）和RI，當待測化合物濃度極低（圖2a～c），或者共流出峰有嚴重干擾時（圖2d，異佛爾酮與苯乙醇共流出），往往難以獲得良好的譜庫匹配結果。即使經驗豐富的感官人員通過準確的氣味描述，在文獻中找到合理的懷疑對象，也只能勉強通過提取離子流圖，找到個別可能存在的碎片（圖2），最終確認定性結果仍需依靠標準品的核對。

表3 基于GC-Orbitrap-MS的“未知”氣味活性化合物定性分析Table 3 Qualitative analysis of four “unknown”aroma-active compounds by GC-Orbitrap-MS

高分辨質譜能夠獲得高信噪比，提高譜庫檢索正/反向匹配度值，還可以提供化合物的準確元素組成。確定元素組成步驟如下：1）通過精確質量數計算得到候選化學式組成；2）計算化學式組成的理論天然同位素分布比例，與實際測比例進行比較，排除錯誤的化學式[32]。GC-Orbitrap-MS由于靜電場軌道阱的設計，同時兼有高分辨率和高靈敏度等優勢[32]，能夠準確檢出并區分痕量天然同位素峰，如丁酸乙酯中的碎片m/z61.028 4（C2H5O2＋）和m/z61.023 9（C13CH4O2），高質量精度（質量偏差＜1×10-6）的數據能夠更精確地推斷化合物的結構。經過解卷積處理的GC-Orbitrap-MS數據首先通過與NIST譜庫的比對，從而獲得候選的化合物信息，然后軟件根據候選化合物的元素組成限定，推算電子電離源質譜圖下每個碎片可能的化學式，以碎片化學式的理論m/z與實測m/z進行比較，最終以高分辨過濾分值的形式呈現出高分辨判定結果，高分辨過濾分值越接近100，表明化合物的可信度越高[33]。

如表3所示，以異丁酸乙酯為例，由于受到共流出干擾，該化合物與NIST譜庫匹配的正向匹配度僅有659，但高分辨過濾分值為100，而且質譜圖中可以明顯找到異丁酸乙酯的分子離子峰m/z116.083 17（理論值m/z116.083 18，質量偏差0.096×10-6），以及分子離子峰的13C同位素峰m/z117.086 51（m/z理論值117.086 54，質量偏差0.222×10-6），該天然同位素碎片的理論占比為6.49%，實測占比6.14%，因此可以確認m/z116.083 17碎片的化學式為C6H12O2。GC-MS在電子電離源下可以獲得豐富的碎片離子信息，通過對化合物主要離子碎片的結構推算，最終可以鑒定RI為760的化合物為異丁酸乙酯。同理可將RI分別為796、829、1 119鑒定為丁酸乙酯、3-己烯-2-酮和異佛爾酮。

3 結 論

相對GC-Q-MS檢測，高分辨GC-Orbitrap-MS靈敏度優勢突出，2 種質譜檢測器分別從醬油中鑒定出91 種和166 種揮發性化合物，高分辨數據總峰面積是低分辨的31.1 倍。在GC-MS-O實驗中，有4 個香氣活性區域分別描述為“果香”、“果香”、“清香，草香”、“花果香”，但在GC-Q-MS上未能準確定性。本實驗利用GC-Orbitrap-MS，在NIST譜庫比對、RI及香氣特征等常規信息基礎上，采用高質量精度的質譜數據推算化合物及其天然同位素組成，全面定性了4 個未知香氣活性物質，分別為異丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-己烯-2-酮和異佛爾酮。實驗證明，GC-Orbitrap-MS能夠有效輔助GC-QMS-O鑒定醬油中未知的氣味活性化合物，這對于醬油中香氣化合物的研究有重要的推動作用，為建立醬油全面的香氣模型提供理論依據。不僅如此，該方法適用于鑒定食品的未知氣味活性化合物，對于食品風味化學研究有著重要意義。考慮到固相微萃取法香氣鑒定具有選擇性，下一階段將進一步研究該法基于液液萃取及溶劑輔助蒸餾萃取法的應用效果。