玉米中5-甲基四氫葉酸提取方法的優化及高效液相色譜法定量分析

王博倫，顧豐穎，張 帆，劉 昊，楊婷婷，邵之曉，王 鋒

（中國農業科學院農產品加工研究所，農業農村部農產品加工重點實驗室，北京 100193）

葉酸是一類對人體健康至關重要的B族維生素，其缺乏是一個全球性的健康問題[1]，會導致如巨幼細胞貧血[2]，心血管疾病惡化[3]和某些類型癌癥等疾病[4]；胎兒缺乏會發生神經管缺陷等相關疾病[5]。葉酸由對氨基苯甲酸連接蝶呤組成，其中對氨基苯甲酸能夠與一個或多個谷氨酸偶聯，形成單谷氨酸葉酸或多谷氨酸葉酸[6]。天然葉酸以四氫葉酸及其衍生物的形式存在[7]，如5-甲基四氫葉酸（5-methyl-tetrahydrofolate，5-MTHF）、5-甲酰四氫葉酸、10-甲酰四氫葉酸等。5-MTHF是食品中最主要的天然葉酸形態[8-10]，在一些主要蔬菜中，5-MTHF含量超過葉酸總量的85%，而在某些水果中則接近100%[11-13]；5-MTHF生物活性高，是唯一可直接作用于甲基化循環的葉酸形態，缺乏5-MTHF易誘發高同型半胱氨酸血癥；我國已將5-MTHF作為食品營養強化劑列入食品添加劑的范圍，對其添加量、攝入量和適宜人群等做了相應規定。

近年來，越來越多的研究人員通過營養強化育種提高谷物中葉酸含量，攝取葉酸強化食物已成為全球對抗葉酸缺乏癥的策略之一[14-16]。鮮食玉米營養豐富香糯可口，消費人群旺盛，在我國種植面積逐年增加。本實驗所用原材料京科糯928玉米是高葉酸強化玉米，葉酸含量為普通玉米5～10 倍，且5-MTHF含量占比高[17]，可作為葉酸補充食品。受栽培條件、儲運加工環境條件的影響，市場中強化葉酸玉米中的葉酸含量差異大，有必要開展玉米中5-MTHF及總葉酸含量的分析檢測。

食物中總葉酸含量的測定常使用比色法、薄層層析法和微生物法，而高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-質譜更多運用在檢測分析樣品中不同形態葉酸的含量。目前食品中5-MTHF含量的HPLC分析法已應用于菠菜[18]、馬鈴薯[19]以及柑橘[20]等。為確保HPLC法檢測樣品中5-MTHF的精準度和低檢出限，必須注重樣品中被檢物質的提取、富集、純化和檢測等環節，其中提取環節最為關鍵。食品中5-MTHF提取一般采用三酶提取法，即通過α-淀粉酶、蛋白酶水解樣品中的淀粉和蛋白質，釋放與其結合的5-MTHF，再利用葉酸軛合酶，將多谷氨酸葉酸水解為單谷氨酸葉酸，再予以測定。Aiso等[21]使用三酶法提取牛肉以及牛奶中5-MTHF，對各樣品中蛋白酶、α-淀粉酶與葉酸軛合酶添加量進行優化，5-MTHF提取效果均提高50%以上；郭麗瓊等[20]對柑橘中5-MTHF進行分析測定時，添加葉酸軛合酶后5-MTHF測定值提高了57%。對于某些淀粉和蛋白質含量占比低的樣品，蛋白酶或淀粉酶的添加可能不會顯著提高5-MTHF測定值，甚至對測定結果產生負面影響[22]。Iwatani等[23]研究結果表明，三酶共同處理蔬菜類樣品后，5-MTHF測定值出現降低。上述研究表明，提取過程中3 種酶是否添加以及添加量的不同會導致檢測結果的準確性，有必要針對不同樣品開展相應的提取實驗。

目前對玉米中5-MTHF與總葉酸分析方法的相關研究十分有限，玉米中淀粉含量占比高，在提取過程中易導致提取液黏稠，增大5-MTHF分析難度。本實驗采用磷酸鹽溶液提取玉米中5-MTHF及總葉酸，系統分析葉酸浸提液pH值、蛋白酶、α-淀粉酶、大鼠血清添加量、固相萃取（solid phase extraction，SPE）凈化對提取玉米樣品中葉酸的影響；實驗還利用化學轉化將玉米中其他形態葉酸轉化為5-MTHF，以分析測定玉米中總葉酸含量，并分析HPLC方法的加標回收率、精密度和相關系數。為葉酸強化玉米中5-MTHF和總葉酸含量分析提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

京科糯928玉米由中國農業科學院生物技術研究所種植。

5-MTHF標準品（純度＞90%） 瑞士Schirck’s實驗室；甲醇、乙腈、磷酸（均為色譜純） 德國Merck公司；抗壞血酸、β-巰基乙醇（均為分析純） 美國Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

蛋白酶（來自灰色鏈霉菌，≥3.5 U/mg，P5147）、α-淀粉酶（來自米曲霉，～30 U/mg，A6814） 美國Sigma公司；大鼠血清（含有葉酸軛合酶） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1260 II HPLC系統、熒光檢測器、SAX固相萃取小柱（500 mg，3 mL） Agilent科技（中國）有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限公司；CK2000球磨儀 北京托摩根生物科技有限公司；HT 16MM臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；2X-2真空泵 南京真空泵廠；ME104E電子天平、FE20 pH計 瑞士Mettler Toledo公司；反相Aquasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm） 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

玉米樣品為京科糯928品種，在收獲采摘后，脫粒混勻以減少玉米穗個例間差異；隨后使用液氮速凍，儲存于-80 ℃環境中。待使用樣品時，取出置于球磨儀中1 000 r/min研磨90 s，制備玉米樣品勻漿。

1.3.2 溶液配制

葉酸浸提液：使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制100 mmol/L pH 6.5磷酸鈉緩沖溶液，在磷酸鹽緩沖液中加入0.01 g/mL抗壞血酸和體積分數0.5%β-巰基乙醇溶液以配制為葉酸浸提液。

標準品儲備液、工作液：分別精確稱取5-MTHF標準品5.0 mg于50.0 mL棕色容量瓶中，用葉酸浸提液溶解并定容至刻度，即得100 μg/mL標準儲備液。將標準儲備液稀釋至不同質量濃度以配制成標準工作液。

酶溶液：分別精準稱取10 mg蛋白酶及100 mgα-淀粉酶溶于5 mL超純水中，配制2 mg/mL的蛋白酶溶液和20 mg/mL的α-淀粉酶溶液。

SPE洗脫液：取5 g氯化鈉、0.5 g抗壞血酸鈉以及0.05 mLβ-巰基乙醇于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L乙酸鈉溶液定容，配制為SPE洗脫液。

1.3.3 玉米籽粒中葉酸提取條件的設計

在De Brouwer等[24]的提取葉酸和5-MTHF的方法基礎上進行優化。取1 g玉米勻漿與5 mL葉酸浸提液渦旋混合為葉酸提取液。樣品充分混勻后，沸水浴處理5 min。在冰上冷卻至室溫后加入一定量的α-淀粉酶（12 U/mL），37 ℃水浴振蕩器中溫浴30 min。取出后添加一定量的蛋白酶（0.028 U/mL），37 ℃水浴，1 h后進行沸水浴5 min。冰上冷卻后加入一定量的大鼠血清（14 μL/mL），37 ℃水浴4 h。水解完成后煮沸5 min，冷卻至室溫。4 ℃、14 000×g離心15 min，上清液過0.22 μm濾膜，為待凈化提取液。

1.3.3.1 葉酸浸提液的pH值

pH值的變化會影響5-MTHF及其他形態葉酸的穩定性，也會影響α-淀粉酶、蛋白酶以及大鼠血清中葉酸軛合酶的酶活，因此考察pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5浸提液對5-MTHF和總葉酸提取的影響。

1.3.3.2α-淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清的添加量

分別考察3 種酶添加量對葉酸提取效果的影響，設定α-淀粉酶添加量分別為0、6、12、18、24 U/mL；蛋白酶添加量為0、0.014、0.028、0.042、0.056 U/mL；大鼠血清添加量分別為0、6、12、14、18 μL/mL。每組實驗重復3 次，取平均值。固定的單因素試驗條件為α-淀粉酶添加量為12 U/mL，蛋白酶添加量為0.028 U/mL，大鼠血清添加量為14 μL/mL。

1.3.4 葉酸的形態轉化

由于玉米中天然葉酸形態多樣，主要形態為5-MTHF，為簡化玉米中總葉酸含量的分析，將各種形態的葉酸全轉化為5-MTHF以測定玉米樣品中總葉酸含量，轉化步驟參考Ndaw等[25]的方法（圖1）。

圖1 不同形態葉酸轉化為5-MTHF步驟Fig.1 Flow chart of conversion of folate into 5-MTHF

取5 mL待凈化葉酸提取液，加入66 mmol/L pH 7.8 Tris緩沖液15 mL，再加入1 mL 2-辛醇以消泡；隨后加入10 mL 120 g/L NaBH4溶液，混勻后靜置10 min；用5 mol/L乙酸調節pH值至7.4。加入80 μL 37%甲醛溶液；振蕩混勻后，1 min內小心加入10 mL 120 g/L NaBH4溶液。然后用37%濃鹽酸調pH值小于1.0，溶液靜置10 min后用5 mol/L NaOH溶液調pH 5，再次小心加入10 mL 120 g/L NaBH4溶液，溶液振蕩均勻后靜置20 min；用Tris緩沖液將溶液的體積定容到100 mL；溶液分層后將上層的2-辛醇去除。剩余溶液過0.45 μm濾膜，為葉酸形態轉化后的待凈化總葉酸提取液。

1.3.5 提取液的SPE凈化

首先分別使用2×2.5 mL甲醇和2×2.5 mL超純水以1～2 滴/s的流速活化固相萃取小柱。測定5-MTHF含量或總葉酸含量時，吸取2.5 mL待凈化提取液，加到活化后的SPE小柱上，流出速率同樣為1～2 滴/s，樣品吸附完畢后，使用2.5 mL超純水清洗小柱。隨后使用3.2 mL SPE洗脫液緩慢（流速不超過1 滴/s）洗脫葉酸。收集目標物洗脫液，過0.22 μm濾膜，將凈化樣品液轉移到HPLC進樣瓶中，為HPLC待測液。

1.3.6 HPLC測定參數

HPLC條件：1260 II HPLC系統，反相Aquasil C18柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）配備四元泵，自動取樣器避光恒溫4 ℃；熒光檢測器設定條件為激發波長290 nm，發射波長360 nm。

梯度洗脫程序：流動相為33 mmol/L pH 2.3磷酸鹽緩沖液和乙腈；流速0.4 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。流動相比例變化如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase gradient elution conditions

1.3.7 標準曲線繪制

用葉酸浸提液將5-MTHF標準儲備液稀釋分別為0.003、0.030、0.050、0.070、0.100、0.300、0.500、0.700、1.000 μg/mL，HPLC分析，根據5-MTHF質量濃度（X）和對應的峰面積（Y）確定方程式，得到標準曲線。

1.3.8 回收率、檢出限和定量限計算

用已知量的5-MTHF標準物質品加入到玉米提取物中，按下式計算回收率：

式中：A為在提取液中添加量的5-MTHF標準物質的峰面積；B為加標準品后的樣品提取物峰面積；C為提取物峰面積。

通過信噪比為3和10分別計算檢出限和定量限。

1.4 數據統計分析

每個樣品均為3 個重復。使用t檢驗確定平均值之間的顯著差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線、檢出限及定量限

5-MTHF線性回歸方程為Y=1 556.474X-0.002，R2＞0.999 9；根據信噪比為3確定5-MTHF的檢出限為0.001 μg/mL；信噪比為10確定定量限為0.003 μg/mL，可滿足玉米中5-MTHF含量的測定。

2.2 玉米籽粒中葉酸提取條件的優化

2.2.1 提取液pH值對5-MTHF和總葉酸提取的影響

圖2 提取液pH值對5-MTHF和總葉酸提取的影響Fig.2 Effect of extraction pH on the extraction efficiency of 5-MTHF and folate

如圖2所示，在pH 4～8.5范圍內，葉酸的提取結果差異顯著，隨著pH值的升高，葉酸提取液中的5-MTHF和總葉酸質量濃度表現為先上升后下降的趨勢。pH 6.5時，葉酸提取液中5-MTHF和總葉酸的質量濃度最高，分別為0.117 μg/mL和0.177 μg/mL。酸性條件下，相對5-MTHF，總葉酸提取率受環境影響更大，測定值降低更為明顯，pH 4.0時葉酸提取液中5-MTHF和總葉酸質量濃度分別比pH 6.5時降低了29.06%和41.19%。推測可能除5-MTHF外的其他形態葉酸對低pH值更為敏感（如四氫葉酸），因此在酸性條件提取下總葉酸的損失更大[22]。在pH值從7.0升高到8.5時，由于葉酸在堿性條件下不穩定，5-MTHF和總葉酸質量濃度值下降快速。pH值除了影響葉酸自身穩定性外，也影響酶活性[26]，實驗操作時反復調整pH值會延長提取時間，增大葉酸氧化的概率，因此在葉酸提取過程中應固定pH值。

2.2.2α-淀粉酶添加量對5-MTHF和總葉酸提取的影響

圖3 α-淀粉酶添加量對5-MTHF和總葉酸提取的影響Fig.3 Effect of α-amylase concentration on the extraction efficiency of 5-MTHF and folate

從圖3可以看出，α-淀粉酶添加量顯著影響玉米中5-MTHF和總葉酸提取效果，增大α-淀粉酶的添加量，葉酸提取液中5-MTHF和總葉酸質量濃度升高隨后出現略微下降。α-淀粉酶添加量為12 U/mL時，葉酸提取液中5-MTHF和總葉酸質量濃度最大，分別為0.115 μg/mL和0.179 μg/mL。樣品中若未添加α-淀粉酶，5-MTHF和總葉酸質量濃度僅為0.032 μg/mL和0.054 μg/mL，添加量為6 U/mL時，提取液中5-MTHF和總葉酸質量濃度顯著提高，但比最大值低40.68%和44.13%，推測可能玉米中淀粉會結合或包裹葉酸，影響5-MTHF與總葉酸的提取，同時沸水浴后提取液黏稠，α-淀粉酶液化不充分，不利于葉酸的提取。當α-淀粉酶添加量為18、24 U/mL，5-MTHF和總葉酸提取量出現了下降，猜測可能在蛋白酶用量不變情況下，隨著淀粉酶添加量的增大，影響了后期蛋白酶的酶解效果，導致提取液中葉酸質量濃度降低。

2.2.3 蛋白酶添加量對5-MTHF和總葉酸提取的影響

如圖4所示，蛋白酶添加量為0、0.014、0.028 U/mL時，葉酸提取率隨之增高。在葉酸提取液中加入0.028 U/mL蛋白酶溶液后，5-MTHF和總葉酸質量濃度為0.118 μg/mL和0.176 μg/mL，相對于未添加蛋白酶，分別提高了54.53%和55.74%，推測分析玉米中的天然葉酸可能與蛋白結合，影響葉酸的提取效果。蛋白酶添加量大于0.028 U/mL后，葉酸提取效果差異不明顯。因此，選用蛋白酶添加量為0.028 U/mL。

圖4 蛋白酶添加量對5-MTHF和總葉酸提取的影響Fig.4 Effect of protease concentration on the extraction efficiency of 5-MTHF and folate

2.2.4 大鼠血清添加量對5-MTHF和總葉酸提取的影響

圖5 大鼠血清添加量對5-MTHF和總葉酸提取的影響Fig.5 Effect of rat serum concentration on the extraction efficiency of 5-MTHF and folate

在提取液中加入大鼠血清，其所含的葉酸軛合酶將多谷氨酸葉酸水解為單谷氨酸葉酸。從圖5可以看出，大鼠血清添加量在0、6、12、14 μL/mL時，隨著大鼠血清添加量增加，提取液中5-MTHF和總葉酸質量濃度也相應提高。加入14 μL/mL大鼠血清時，5-MTHF和總葉酸質量濃度分別為0.115 μg/mL和0.176 μg/mL；未添加大鼠血清時，5-MTHF和總葉酸質量濃度僅為添加14 μL/mL大鼠血清的22.61%和22.16%，說明玉米樣品中多谷氨酸葉酸占多數。考慮在大鼠血清添加量大于14 μL/mL后，葉酸提取效果之間差異不明顯，實驗確定大鼠血清的添加量為14 μL/mL。

當3 種酶均未添加時，葉酸提取液中5-MTHF和總葉酸測定值僅為0.011 μg/mL和0.015 μg/mL，低于未添加α-淀粉酶、蛋白酶或大鼠血清處理組，說明添加α-淀粉酶、蛋白酶以及大鼠血清可以提高葉酸的提取效果。

2.2.5 SPE凈化收集洗脫液體積對5-MTHF和總葉酸提取的影響

在HPLC分析樣品之前，純化樣品可提高葉酸檢測準確度和回收率，降低檢出限，減少提取液中內源成分干擾。固定葉酸結合蛋白親和色譜[27-29]凈化提取液時對5-甲酰四氫葉酸的親和吸附力較低，會導致其損失[30-31]，本實驗使用強陰離子交換（SAX）SPE對提取液進行凈化[32]。SPE洗脫液收集體積的量會影響提取的回收率。當截留體積過小時，葉酸收集不完全；當截留體積過大時，會導致洗脫液中葉酸濃度降低，影響測定準確性。因此需準確截取含有葉酸的洗脫液部分。本實驗在洗脫過程中，每0.1 mL收集1 次洗脫液，然后依次測定，結果表明收集洗脫液時可丟棄首先流出的0.7 mL；中間段2.5 mL洗脫液中存在可檢出目標物5-MTHF，回收率達到98.5%。采用以上洗脫收集方式，SPE對葉酸提取液凈化效果顯著。未使用SPE凈化處理組中雜質多，5-MTHF目標峰與相鄰雜質峰部分重合，無法準確定量5-MTHF（圖6A），使用SPE凈化后，5-MTHF相鄰雜質峰消失，且5-MTHF峰形對稱性良好，干擾物少，在16.87 min處出峰（圖6B）。

圖6 葉酸提取液HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of folate extract

2.3 玉米樣品的驗證

表25 -MTHF回收率及精密度Table 2Recovery and precision of 5-MTHF and total folate

對京科糯928玉米中葉酸含量進行分析，結果見表2，京科糯928玉米中總葉酸含量為253.65 μg/100 g，這與董會等[17]運用高效液相色譜-質譜對京科糯928玉米中葉酸含量的測定結果接近。本研究顯示強化葉酸玉米最主要的葉酸形式為5-MTHF，占總葉酸含量的71.36%，這與相關研究中測定5-MTHF占總葉酸含量比例近似。因此本方法能夠滿足玉米中5-MTHF和總葉酸的檢測。

3 結 論

本實驗優化了鮮食糯玉米中5-MTHF和總葉酸的提取凈化方式，建立有效的HPLC檢測方法。在充分考慮玉米基質條件下，葉酸提取液pH值為6.5，α-淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清的最佳添加量分別為12 U/mL、0.028 U/mL、14 μL/mL，SPE凈化柱收集洗脫液2.5 mL時，提取葉酸效果最好，方法的線性范圍在0.003～1.000 μg/mL之間，相關系數達0.999 9，檢出限為0.001 μg/mL，定量限為0.003 μg/mL，精密度為1.90%，樣品加標平均回收率為104.57%；測定葉酸強化玉米（京科糯928）中5-MTHF與總葉酸含量分別為181.18 μg/100 g與253.65 μg/100 g，提取優化后的HPLC檢測方法適用于玉米中5-MTHF與總葉酸的測定，可為其他強化谷物中葉酸含量的測定提供參考。