橄欖果實潛伏病原真菌的分離與鑒定

陳蓬蓮，陳南泉，林河通,，林育釗，陳藝暉

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.亞熱帶特色農產品采后生物學（福建農林大學）福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002；3.福建農林大學農產品產后技術研究所，福建 福州 350002）

橄欖（Canarium album(Lour.) Raeusch），又名青果、青橄欖等，是中國南方亞熱帶的名特優水果，主產于福建、廣東、廣西和臺灣等地[1-2]。橄欖富含多糖、氨基酸、多酚等營養保健成分，具有生津止渴、開胃健脾、助消化、除口臭等保健功效[3-4]，其鮮果及各種加工制品深受消費者喜愛。隨著市場、消費者對橄欖鮮果和加工品的需求量增大，橄欖采后病害問題日益突顯，現有橄欖保鮮技術已不能滿足產業發展和實際生產的需求[5-8]。有研究表明，病原真菌侵染是引起采后橄欖果實腐爛敗壞、影響橄欖果實貨架期和降低其果實經濟價值的主要因素，極大地限制了橄欖果實采后的貯藏、運輸和銷售[3,9-10]。Seifer[11]和Milholl[12]研究表明，病原真菌的侵染主要是通過其分生孢子從機械傷口、氣孔或者是直接穿透表皮入侵寄主，而后在寄主表面形成附著胞進一步入侵，破壞寄主細胞，從而破壞果實表皮細胞而致使果實迅速腐爛敗壞。因此，開展橄欖果實的潛伏侵染病害研究，對橄欖果實采前或采后的真菌病害防治，延長橄欖果實貨架期，減少其經濟損失具有重要意義。

本課題組研究發現，小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）是引起采后橄欖果實果腐病和導致果實腐爛的主要病原菌[8,13]。目前，相關研究未能明確導致采后橄欖果實腐爛的主要病原菌種類及其采前侵入時期，為了進行橄欖果實無公害保鮮，本實驗以福建省主栽品種‘長營’橄欖（Canarium album(Lour.)Raeusch cv.Changying）果實為研究材料，在橄欖不同生長階段對其花器、果實上的真菌進行分離和鑒定，旨在明確引起采后橄欖果實貯藏期病害的主要病原真菌種類，并討論橄欖潛伏性真菌病害的發生規律，為控制橄欖果實采后病害發生、延長其果實貯藏保鮮期和提高橄欖果實的經濟價值提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖樣品采自福建省閩侯縣白沙鎮綠百合農場橄欖果園（商業無污染管理果園）：在果園的不同方位選定10 棵‘長營’橄欖樹，從橄欖花期至果實成熟期（5～11月）的5 個不同生長階段取樣（圖1），即從每株橄欖樹隨機摘取橄欖盛花期花器（5月28日）、幼果（6月20日）、膨大期果實（7月8日）、成熟前期果實（8月26日）和成熟期果實（11月23日）各30 個，同時也采收果實不同生長階段的病葉，之后分別裝袋、貼標簽，采收當天運回福建農林大學食品科學學院食品貯藏保鮮實驗室。

圖1 ‘長營’橄欖潛伏性侵染病原菌分離的5 個不同時期Fig.1 Five different stages for pathogen isolation from ‘Changying’Chinese olive

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar medium，PDA） 廣東環凱微生物科技有限公司；酒精、次氯酸鈉、苯酚、氯仿、異戊醇、十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）等（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；真菌通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-3立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DRX-260低溫人工氣候箱 寧波江南儀器廠；Olympus HB光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Applied Biosystems實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 潛伏病原真菌的分離與純化

參考張居念[14]和秦士維[15]等的方法，對橄欖花器、果實進行表面消毒，然后運用常規組織分離法[10,16]得到組織塊、并接種在含有100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的PDA培養基平板上，之后放置在人工氣候箱中28 ℃恒溫培養。當菌落直徑長至1 cm左右時，用無菌接種針挑取菌落邊沿菌絲、并接種在新的PDA平板上進行培養，重復上述操作3 次，即可獲得純化菌株。

1.3.2 病原菌的致病性測定與形態鑒定

運用科赫氏法則[17-18]進行。采后健康的橄欖果實，經酒精消毒、無菌水清洗晾干，用損傷接種（針刺）法，將菌餅（φ=5 mm）接種在橄欖果實表面，用塑料托盤裝接種的橄欖果實、外用聚乙烯薄膜保鮮袋密封包裝，在28 ℃人工氣候箱中培養；以接種無菌的PDA培養基塊（φ=5 mm）作為對照。以上處理重復3 次。病原菌接種橄欖果實發病后，從橄欖果實發病部位再分離病原菌，并與原接種病原菌菌株進行比較，其余橄欖果實繼續培養觀察、并記載發病癥狀。

將再分離的病原菌接種在PDA平板上，置于28 ℃恒溫箱中培養，根據病原菌在PDA平板上的培養性狀、菌落顏色、及顯微鏡下病原菌分生孢子形態、大小等特征，初步鑒定橄欖病原菌種類，并用顯微鏡測微尺測量病原菌分生孢子的大小、并拍照記錄。

1.3.3 病原菌的分子生物學鑒定

1.3.3.1 菌絲體的收集及其基因組DNA的提取

將病原菌接種于鋪有無菌玻璃紙的PDA平板上，置于28 ℃人工氣候箱中培養，待菌落快長滿整個平板時，用無菌鑰匙刮取菌絲體、并用無菌水清洗3 次，然后用無菌濾紙吸干表面水分，液氮研磨后轉移至1.5 mL離心管中，運用改良的CTAB法[19]，提取病原菌基因組DNA作為PCR擴增的模板。

1.3.3.2 病原菌ITS區PCR擴增及其序列測定

選用真菌通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[20-21]對病原菌基因組DNA進行PCR擴增。

20 μL PCR反應體系：包括10×ExTaqbuffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 1.6 μL，引物ITS-1和ITS-4各0.8 μL，5 U/μL ExTaq0.2 μL，模板0.5 μL，ddH2O 14.1 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個循環；72 ℃修復延伸10 min，4 ℃保持。之后用1 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR擴增產物，電壓100 V，時間40～45 min，溴化乙錠溶液染色10 min。

參照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒所介紹的方法，對目的產物片段進行純化回收。PCR產物序列的測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.3.3 序列比對和系統發育樹的構建

測序結果在NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行BLAST分析，獲得親緣關系最近的菌株的ITS序列，運用MEGA 6.0軟件的鄰接法（neighborjoining，NJ）構建系統發育樹[22-24]，采用Bootstrapsjoining法進行檢驗，重復1 000 次。

2 結果與分析

2.1 橄欖不同生長階段果實和葉片潛伏性真菌的分離結果

在橄欖果實和葉片的5 個生長階段（盛花期、幼果期、果實膨大期、果實成熟前期和果實成熟期），共分離到6 個屬的真菌，分別編號GL-1、GL-3、GL-5、GL-6、GL-7、GL-8，其中以GL-8和GL-3的分離頻率最高。在橄欖5 個不同生長階段的果實和葉片中，分離到的病原菌種類和頻率有所差異（表1和表2）。其中GL-8和GL-3在橄欖果實和葉片中的分離頻率都最高，而GL-1、GL-5、GL-6和GL-7這4 種真菌的分離頻率都比較低。據此認為，GL-8和GL-3是橄欖果實和葉片最主要的潛伏性病原真菌，在橄欖盛花期即可侵染。

進一步比較發現，與果實成熟前期相比，成熟期橄欖果實中2 個主要真菌GL-8和GL-3的分離頻率下降（表1），而果實成熟期采收的葉片中GL-8和GL-3的分離頻率上升（表2）；此外，成熟期橄欖果實中GL-1、GL-5、GL-7的分離頻率上升（表1），但果實成熟期采收的葉片中GL-1、GL-5、GL-7的分離頻率下降（表2）。因此認為，橄欖果實和葉片的病原菌之間存在相互侵染現象；而成熟期橄欖果實的主要病原真菌侵染源，可能是該病原真菌在橄欖葉片上越夏或越冬造成的。

表1 橄欖果實不同生長階段分離的病原菌種類及其分離頻率Table 1 Pathogens isolated from Chinese olive fruit at different development stages and their isolation frequency

表2 橄欖果實不同生長階段采收的葉片分離的病原菌種類及其分離頻率Table 2 Pathogens isolated from the leaves of Chinese olive at different fruit development stages and their isolation frequency

2.2 2 種主要潛伏性真菌的致病性測定和形態鑒定

2.2.1 GL-8

圖2 橄欖GL-8的形態特征、致病性測定及病果癥狀Fig.2 Morphological features, pathogenicity identification and fruit disease symptoms of GL-8

取無病蟲害、無機械損傷的橄欖果實，經表面消毒后，在橄欖果實表面接種GL-8的菌絲塊。接種后的第2天，在橄欖果實病原菌接種處出現水漬狀病斑；接種后的第3天，橄欖果實病斑上出現稀薄的灰色絮狀菌絲；接種3 d之后，隨培養時間的延長，橄欖果實的病斑逐漸擴大，培養至第6天，橄欖果實全部腐爛，菌絲逐漸由灰色變為深灰色。而自然未接種的橄欖果實在發病前期，其果實局部變褐色、并伴有較少的白色菌絲；在橄欖果實發病后期，整個橄欖果實表面呈深灰色且部分凹陷，橄欖果實局部出現黑色斑點、并伴有灰色菌絲體。接種GL-8菌絲塊的橄欖果實病害癥狀與自然發病的橄欖果實癥狀相同（圖2A、B）；進一步觀察證實，從GL-8菌絲塊接種的橄欖果實中再次分離病原菌GL-8，在PDA培養基上培養，其菌落形態、菌絲形態及分生孢子與自然分離得到的GL-8相同。顯微鏡下觀察發現，GL-8的分生孢子無色、無隔、紡錘形，大小為（18.0～28.5 μm）×（3.5～6.0 μm）（圖2F），分生孢子著生于子囊內（圖2D），子囊著生于子囊腔內（圖2E）。GL-8在PDA培養基上培養，最初出現白色氣生菌絲、而后逐漸變為灰色到深灰色；在PDA培養基上培養的初期，PDA平板背面的顏色為白色，培養2～3 d之后，其顏色從PDA平板背面的中心開始變為墨綠色、橄欖綠，之后著色逐漸擴展到PDA平板背面的邊緣、而且PDA平板背面的中心顏色進一步加深，直到整個菌落都成為黑色（圖2C）。根據菌落形態、菌絲和分生孢子形態特征，將GL-8初步鑒定為子囊菌門葡萄座腔菌科（Botryosphaeriacea）的小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）。

2.2.2 GL-3

取無病蟲害、無機械損傷的橄欖果實，經表面消毒后，在橄欖果實表面接種GL-3菌絲塊。接種后的第2天，在橄欖果實病原菌接種處出現淡褐色并伴有微量菌絲（圖3B）；接種培養后期，橄欖果實表面凹陷、且產生大量的疏松菌絲，菌絲顏色呈白色（圖3C）。而自然未接種的橄欖果實發病前期，橄欖果實表面出現微量灰白色菌絲、并伴有不規則黑色斑點；在橄欖果實發病后期，整個橄欖果實被灰白色菌絲包裹，且菌絲體表面伴有黑色小粒分生孢子盤，橄欖果實表面凹陷、且伴有淡黃色暈圈。接種GL-3菌絲塊的橄欖果實病害癥狀與自然發病的橄欖果實癥狀相同（圖3A）；進一步觀察證實，從GL-3菌絲塊接種的橄欖果實中再次分離病原菌GL-3，將其在PDA培養基上培養，其菌落形態、菌絲形態及分生孢子與自然分離得到的GL-3相同。GL-3在PDA培養基上培養，出現白色的菌落及菌絲，并呈現花瓣式輪紋狀（圖3D）。顯微鏡下發現，GL-3的分生孢子有5 個細胞，呈紡錘狀，中間3 個細胞呈褐色；孢子頂端無色，有2～3 根頂部附屬絲；尾部細胞無色，有1 根中生式尾毛（圖3E）。根據菌落形態、菌絲及分生孢子形態特征，將GL-3初步鑒定為小孢擬盤多毛孢（P.microspora）。

圖3 橄欖GL-3的形態特征、致病性測定及病果癥狀Fig.3 Morphological features, pathogenicity identification and fruit disease symptoms of GL-3

2.3 橄欖果實主要潛伏性侵染病原菌的分子生物學鑒定

2.3.1 基因組DNA提取和PCR擴增

采用CTAB法提取病原菌總DNA，以通用引物ITS-1和ITS-4對分離到的6 種病原菌核糖體基因轉錄間隔區（ribosomal gene internal transcribed spacer，rDNA-ITS）序列進行擴增，并將得到的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，6 種病原菌擴增產物都是單一條帶，無非特異擴增現象，且各菌株的rDNA-ITS序列片段大小均在600 bp左右（圖4）。

圖4 橄欖果實6 種潛伏性病原菌的rDNA-ITS擴增電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR-amplified rDNA-ITS products of six latent pathogens from Chinese olive fruit

2.3.2 rDNA-ITS序列同源性比對及系統發育分析

運用GenBank的序列局部相識查詢BLAST工具，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站上的GenBank序列數據庫中，搜索與上述6 株病原真菌所測得的序列相似的rDNA-ITS序列，并進行分析比較。然后用MEGA6.0軟件的NJ法構建系統發育樹，并通過Bootstraps法進行檢驗，重復次數為1 000。

如表3和圖5所示，分離到的6 種病原真菌與相關屬內參比菌株的rDNA-ITS序列相似度都為99%或100%。據此認為，GL-1為擬莖點霉屬（Phomopsis）、GL-3為小孢擬盤多毛孢（P.microspora）、GL-5為革菌屬（Phanerochaete）、GL-6為出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、GL-7為球座菌屬（Guignardia）、GL-8為小新殼梭孢（N.parvum）。

表3 橄欖果實病原真菌rDNA-ITS序列與相近菌株相似性比對Table 3Similarity of rDNA-ITS sequence between strains isolated from Chinese olive fruit and related strains

圖5 橄欖果實6 種潛伏性病原菌的系統發育樹（NJ法）Fig.5 Phylogenetic tree established by the Neighbor-joining method for each of six latent pathogens from Chinese olive fruit

3 討 論

陳瑾[25]和張紹升[26]等從橄欖果實中分離到多種病原微生物，但未能明確導致采后橄欖果實腐爛的主導病原真菌種類、及其侵入時期。本實驗采用組織分離法，在橄欖不同生長階段的果實和葉片中，分離出橄欖潛伏病原真菌種類、并統計其分離頻率，進一步對橄欖潛伏病原真菌的致病性測定、形態學鑒定和分子生物學鑒定，明確了橄欖果實采后貯藏期腐爛敗壞、主要是由于病原真菌的采前潛伏侵染所導致，且明確了主要病原菌種類為小新殼梭孢（N.parvum）和小孢擬盤多毛孢（P.microspora）。而球座菌屬（Guignardia）、擬莖點霉屬（Phomopsis）、革菌屬（Phanerochaete）和出芽短梗霉（A.pullulans）等病原菌在橄欖不同生長階段的分離頻率都處于較低水平，這可能是由于橄欖果實中存在抗性物質、能有效抑制以上分離頻率較低的4 種病原真菌生長，或者是由于病原菌生長的競爭作用、導致以上4 種病原真菌不能有效生長繁殖。

此外，本實驗通過分離橄欖果實不同生長階段葉片的病原真菌種類、并統計其分離頻率，發現各生長階段的橄欖葉片主要病原菌種類與橄欖果實的主要潛伏性病原菌種類一致。因此認為，橄欖果實和葉片的病原菌之間存在相互侵染的現象。

屬于葡萄座腔菌科（Botryosphaeriacea）的小新殼梭孢（N.parvum）是導致柑橘[27]、草莓[28]、鱷梨[29]、蘋果[30]、桃[31]、葡萄[32]等果實腐爛的病原菌，N.parvum侵染果實初期，在果實表面會出現水漬狀凹陷；隨著果實腐爛的加劇，果實表面產生大量菌絲，隨后干癟，表面長出許多黑色分生孢子器。小孢擬盤多毛孢（P.microspora）是番石榴果實的重要致病菌，該病原菌爆發會嚴重影響番石榴果實品質及其經濟價值[33]。本實驗研究發現，N.parvum和P.microspora在橄欖盛花期就已經潛伏侵染于花器中，而病原菌的活性一直處于較低水平，待橄欖果實采摘后，因采后橄欖果實抗性下降，其病原菌活性增強，從而導致采后橄欖果實病害大量爆發、果實腐爛敗壞，嚴重影響橄欖果實經濟價值。

本研究選用橄欖花器、果實作為實驗材料，對其潛伏性病原真菌進行分離、鑒定。由于病原菌的生長繁殖受外界氣候條件影響較大，且同一橄欖品種在同一地區不同年份、及不同橄欖品種中，其病原菌種類及其分離頻率存在一定的差異，具體差異有待于進一步研究。此外，本實驗尚未研究橄欖病原菌的侵染來源及其侵染過程，因此，需要進一步研究橄欖病原菌的來源及其侵染機制，將為橄欖果實采前病害的防治提供理論依據。

另外，本實驗雖然已鑒定出N.parvum、P.microspora為橄欖果實最主要的潛伏性病原真菌，但有關自然狀態下貯藏，這2 種病害的發生率值得進一步研究；另外，本實驗研究認為，橄欖潛伏性病原真菌推測為盛花期侵染，但病原真菌在盛花期侵染后潛伏于何處、最后又如何轉移到橄欖果實上，病原真菌在盛花期侵染如何在橄欖果實上潛伏至采后貯藏后期，以及橄欖果實不同部位潛伏侵染菌分布是否存在差異等問題值得今后進一步探討。

4 結 論

綜合以上分析，發現小新殼梭孢（N.parvum）、小孢擬盤多毛孢（P.microspora）、擬莖點霉屬（Phomopsis）、革菌屬（Phanerochaete）、球座菌屬（Guignardia）、出芽短梗霉（A.pullulans）6 種病原真菌是引起采后‘長營’橄欖腐爛的病原菌。其中小新殼梭孢（N.parvum）和小孢擬盤多毛孢（P.microspora）為‘長營’橄欖果實最主要的潛伏性病原真菌，在橄欖盛花期即可侵染。上述結果為制定病原真菌采前侵染橄欖果實的控制策略提供科學依據，進而為控制橄欖果實采后病害發生、延長其保鮮期提供一定科學依據和生產實踐指導。