甘肅河西走廊葡萄酒產區本土酒酒球菌發酵耐受性分析

祝 霞，王璐璐，趙丹丹，王 詩，韓舜愈，楊學山

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）主要由酒酒球菌（Oenococcus oeni）誘發和主導，可有效柔化葡萄酒酸度，增加微生物穩定性，修飾酒體風味，是釀造高品質干紅和部分干白葡萄酒必不可少的工藝環節[1]。雖然在適宜的條件下MLF可以自然啟動，但自然起酵酒樣中微生物種類較多，導致MLF往往難以預測和控制，因此純種發酵是控制MLF順利進行的主要手段之一[2]。在葡萄酒釀造過程中多個發酵條件共同作用和影響O.oeni的生存和生長，優良O.oeni菌株通常能夠在低pH值、高乙醇體積分數、高SO2質量濃度以及低發酵溫度的葡萄酒環境中生存[3-4]。近年來，為改善商業化菌株大量推廣應用導致的酒品標準化、同質化問題，關于本土優良O.oeni菌種的篩選、鑒定及其對酒質提升、呈現產區微生物風土的相關研究成為了行業關注的焦點[5]。已有學者對西班牙[6]、阿根廷[7]、葡萄牙[8]、意大利[9]等國葡萄酒產區自然啟動MLF酒樣中分離的本土O.oeni進行了發酵耐受性和釀造特性分析，獲得了代表產區風土特征的優良菌株。張春暉[10]、盧新軍[11]、薛雪[12]、喬慧等[13]分別對從山東煙臺、河北昌黎、寧夏銀川、內蒙古葡萄酒產區篩選得到的本土O.oeni進行發酵適應性研究，得到發酵特性優良的本土O.oeni菌株，應用于葡萄酒發酵后保證了所產葡萄酒的品質和地域風格。

甘肅河西走廊產區地域廣闊、生態條件相對復雜，加之釀酒葡萄種植歷史悠久[14]，必然存在著適應產區風土的優良O.oeni菌株，具備釀造高品質葡萄酒的潛力。在實際生產中，由于受發酵成本、商業化菌株與釀酒葡萄品質適應性等因素限制，絕大多數葡萄酒生產企業選擇不進行或采用進口商品發酵劑完成MLF，導致所釀葡萄酒缺乏產區風格和特色。本研究以甘肅河西走廊產區生產企業自然啟動MLF的酒樣中分離鑒定的7 株本土O.oeni為供試菌株，利用單因素結合不完全正交試驗分析評價不同發酵條件下各菌株的耐受性，以期篩選出釀造適應性優良的菌株，為進一步探究菌株的發酵特性以提升甘肅河西走廊產區葡萄酒品質提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：O.oeni菌株MG-1、MG-7、MG-10、QL-9、QL-11、GF-2、ZX-1，均從甘肅河西走廊葡萄酒產區生產企業自然啟動MLF葡萄酒中分離、鑒定，-80 ℃甘油管保存。

蛋白胨、酵母浸粉、硫酸鎂、硫酸錳、氫氧化鈉、無水葡萄糖、鹽酸、酒石酸、無水乙醇、偏重亞硫酸鈉天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

LRH生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；UV-6100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；BCD642WDVMU1立式冰箱 青島海爾股份有限公司；pHS-3C精密pH計 上海雷磁場儀器廠；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸性番茄（acid tomato juice，ATB）培養基的配制

ATB培養基配方[15]：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，鹽酸半胱氨酸0.5 g/L，番茄汁25%（V/V）。液體培養基使用1 mol/L NaOH溶液調pH值至4.8，固體培養基調pH值至5.0，并向其中加20 g/L瓊脂，121 ℃滅菌20 min。其中葡萄糖于115 ℃滅菌15 min，在超凈工作臺內按比例混合。

1.3.2 菌株活化

配制ATB液體培養基，121 ℃濕熱滅菌20 min后，置于無菌超凈工作臺中冷卻。取冷凍保存的O.oeni菌株，置室溫2 h后，從斜面培養基上挑取2 環接種至配制好的液體培養基中，于28 ℃培養箱中擴大培養。

1.3.3 菌株耐受性單因素試驗

1.3.3.1 pH值

將活化擴培處于對數生長期的供試菌株以107CFU/mL接種量，分別接種于pH值為3.0、3.2、3.5、3.8、4.0的ATB液體培養基中（HCl或NaOH溶液調節pH值），28 ℃靜置培養，用分光光度計測定其OD600nm值。

1.3.3.2 乙醇體積分數

將處于對數生長期的供試菌株以107CFU/mL接種量，分別接種于乙醇體積分數為6%、8%、10%、12%、14%的ATB液體培養基中（用無水乙醇調節乙醇含量），28 ℃靜置培養，用分光光度計測定其OD600nm值。

1.3.3.3 SO2質量濃度

將處于對數生長期的供試菌株以107CFU/mL的接種量，分別接種于SO2質量濃度（以偏重亞硫酸鈉計）為20、40、60、80、100 mg/L的ATB液體培養基中，28 ℃靜置培養，用分光光度計測其OD600nm值。

1.3.3.4 發酵溫度

將處于對數生長期的鑒定菌株以107CFU/mL的接種量接種于ATB液體培養基，分別置于16、18、20、22、25 ℃條件下靜置培養，用分光光度計測定其OD600nm值。

1.3.4 耐受性復合因素試驗

根據單因素試驗結果，結合甘肅河西走廊產區葡萄酒MLF的生產實際，對供試菌株在不同水平下進行pH值（3.2、3.5）、乙醇體積分數（10%、12%、14%）、SO2質量濃度（20、40 mg/L）的復合因素釀造耐受性分析[12]。

1.4 數據處理與分析

對供試樣本所得數據采用Microsoft Office Excel 2010，Origin 2018進行基本處理和作圖，IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行Duncan多重比較以及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 供試O.oeni單因素耐受性分析

2.1.1 菌株對pH值的耐受性

圖1 pH值對O.oeni生長的影響Fig.1 Effect of pH value on the growth of O.oeni

pH值是影響O.oeni生長最主要的生境因素之一[8]。由圖1可知，pH值對不同菌株的影響趨勢具有相似性，隨著pH值的逐漸降低，菌株的生長量均不斷減少。對同一菌株而言，其對不同水平pH值的耐受性不同。其中O.oeni菌株MG-1、MG-7、MG-10、QL-11和GF-2均在不同的pH值梯度下表現出顯著差異（P＜0.05）。菌株MG-10和GF-2受pH值影響最大，在pH 4.0和pH 3.0時2 株菌的菌液OD600nm值分別為1.295和0.205（MG-10），1.080和0.149（GF-2），其生長量分別降低了約84%和86%。

在同一pH值的脅迫壓力下，不同O.oeni菌株的耐受性存在差異。當pH值為4.0時，所有菌株生長量之間存在顯著差異（P＜0.05），且MG-1的生長量最大，OD600nm值約為1.4，MG-7次之；在pH值為3.8時，菌株MG-7和MG-10的生長量無顯著差異（P＜0.05），所有菌株生長良好，OD600nm均在0.8以上；當pH＜3.5時，所有菌株的生長均受到抑制，其中在pH 3.2條件下，MG-10、QL-9和GF-2受到的抑制作用最強，而MG-1表現最為突出（OD600nm=1.045），且與其他各菌株間存在顯著差異（P＜0.05）；當pH值為3.0時，各菌株受pH值的抑制作用最強，且除QL-9和QL-11之間無顯著差異外，其他各菌株間都具有顯著差異（P＜0.05）。總體分析，菌株MG-1、MG-7和ZX-1在pH值小于3.5時耐受性良好。

2.1.2 菌株對乙醇的耐受性

發酵過程中產生的乙醇對O.oeni具有抑制作用，且抑制程度取決于乙醇體積分數及發酵菌株的抗脅迫能力[15-16]。由圖2可知，乙醇體積分數與菌株生長量呈負相關關系，隨著乙醇體積分數的不斷升高，菌株生長量呈明顯下降趨勢。同一菌株對不同體積分數乙醇的抗性存在差異。在6%的乙醇體積分數下，各菌株生長量最大，表明較低的乙醇體積分數可以刺激O.oeni的生長；而在12%和14%的高乙醇體積分數下，菌株生長明顯受到抑制，且各菌株之間的耐受性存在顯著差異（P＜0.05）。

圖2 乙醇體積分數對O.oeni生長的影響Fig.2 Effect of alcohol content on the growth of O.oeni

不同菌株對不同乙醇體積分數的抗性也表現出較大的差異。在6%和8%的低乙醇體積分數下，菌株MG-1、MG-7、MG-10、QL-11和ZX-1表現出較強的乙醇耐受性，而QL-9和GF-2耐受能力較弱。其中ZX-1能夠在14%的乙醇體積分數下維持增殖，OD600nm值可達到0.582，與其他供試菌株相比具有顯著差異（P＜0.05），表明ZX-1對高濃度乙醇的抗性更強。

2.1.3 菌株對SO2的耐受性

SO2通常作為抗氧化劑添加到葡萄酒中，能夠同時抑制野生酵母和雜菌的生長，從而降低葡萄酒發酵過程中腐敗的風險[17]。然而，一定質量濃度的SO2對O.oeni的正常生長和增殖具有明顯的抑制作用。由圖3可知，在20 mg/L和40 mg/L的SO2質量濃度下，各菌株均生長良好（OD600nm＞0.6），表明菌株對較低質量濃度的SO2具有較強的耐受性。隨著SO2質量濃度的增加，菌株受到的抑制作用不斷增強，當SO2質量濃度達到80 mg/L及以上時，幾乎能夠對所有菌株的正常生長產生強烈抑制作用。不同O.oeni菌株對SO2的抗性不同。由圖3可知，所有菌株均能夠在60 mg/L的SO2質量濃度下維持生長，其中以菌株QL-11、QL-9和ZX-1表現較佳，尤其是菌株QL-11，其在不同SO2質量濃度下與其他菌株都具有顯著差異（P＜0.05），并能夠在80 mg/L的高SO2質量濃度下增殖，具有較強的SO2耐受性。

圖3 SO2質量濃度對O.oeni生長的影響Fig.3 Effect of SO2 concentration on the growth of O.oeni

2.1.4 菌株對發酵溫度的耐受性

發酵溫度是影響O.oeni生長的關鍵因素之一，不適宜的溫度對菌株正常生長具有明顯的抑制作用[18]。由圖4可知，隨著發酵溫度的不斷降低，菌株生長量也隨之減少。菌株MG-7、QL-11、GF-2和ZX-1分別在25、22 ℃和20 ℃時的生長量具有顯著差異（P＜0.05），且25 ℃菌株生長量最高；而對菌株MG-1、MG-10及QL-9影響較小。而在18 ℃和16 ℃條件下，所有菌株生長量開始顯著下降，其中MG-10、QL-9及GF-2菌株的生長量較小。比較不同菌株在各發酵溫度下的生長量可知，菌株ZX-1對較低的發酵溫度耐受能力最強，其次為MG-7和QL-11。與各菌株對pH值、乙醇和SO2質量濃度的耐受性相比較，發酵溫度對供試菌株的影響差異相對小。

圖4 發酵溫度對O.oeni生長的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the growth of O.oeni

由耐受性單因素試驗結果可知，菌株GF-2在pH 3.0的條件下，其生長受到強烈抑制，OD600nm值僅為0.149；菌株MG-10、QL-9和GF-2對乙醇較為敏感，尤其QL-9和GF-2在低乙醇體積分數（6%）下，其OD600nm值僅為0.623和0.526，顯著低于其他菌株生長量（P＜0.05），而在高乙醇體積分數（14%）下，MG-10（OD600nm=0.179）、QL-9（OD600nm=0.063）和GF-2（OD600nm=0.128）幾乎不能生長增殖；菌株MG-10對SO2抗性較弱，在SO2質量濃度為60 mg/L的條件下菌株生長受到明顯抑制，生長量（OD600nm=0.281）顯著低于其他菌株（P＜0.05）；在16 ℃的低溫下，菌株MG-10（OD600nm=0.715）、QL-9（OD600nm=0.699）和GF-2（OD600nm=0.716）生長量之間無顯著差異（P＞0.05），且均顯著低于其他菌株生長量（P＜0.05）。因此，選擇對pH值、乙醇、SO2質量濃度和發酵溫度耐受性較好的菌株MG-1、MG-7、QL-11和ZX-1，進行釀酒因素復合耐受性評價。

2.2 菌株復合因素耐受性分析

MLF能否順利進行取決于O.oeni菌株對葡萄酒整體生境的耐受性。在葡萄酒釀造過程中，多個發酵可能協同抑制O.oeni生長，會導致MLF的延滯或終止，使發酵過程難以啟動或完成[12]。因此，考察復合因素條件下O.oeni的耐受性，對有效控制MLF更具有參考價值。

表1 菌株耐受性正交試驗設計與結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

單因素耐受性結果表明，菌株MG-1、MG-7、QL-11和ZX-1在不同發酵溫度下（16～25 ℃）都可以生長增殖，但在18 ℃條件下，所有菌株生長量開始明顯下降。而在實際生產中，較高的MLF溫度會導致揮發酸含量增加，降低葡萄酒的感官品質[19-20]。因此選擇在20 ℃的條件下考察復合因素耐受性。表1結果表明，與單因素結果相比，在復合因素作用下4 株菌的生長量均有降低。在相同的處理條件下，不同菌株的生長量存在顯著差異（P＜0.05）。在1～12 組的處理條件下，對復合因素抗性最好的菌株均為ZX-1，其次是MG-1（第1～6組和第9組）和QL-11（第7、8、10、11、12組）。隨著復合因素脅迫程度的不斷增加，同一菌株的生長量具有顯著差異性（P＜0.05），其中菌株MG-1的第5組和第9組差異性不顯著，MG-7的第5組和第12組、第3組和第11組之間無顯著差異，ZX-1的第12組和第9組無顯著差異（P＞0.05）。

對12 組處理進行綜合比較，可以看出第7組處理（pH 3.5，乙醇體積分數10%，SO2質量濃度20 mg/L）對菌株生長的抑制程度最小，而第6組處理（pH 3.2，乙醇體積分數14%，SO2質量濃度40 mg/L）對其生長的抑制作用最大。同時，在最強脅迫處理條件下（第6組），菌株ZX-1的生長量最高，其OD600nm值為0.413，其次是MG-1（OD600nm=0.281），相對于其他菌株而言這2 株菌對脅迫強度最大的復合因素的抗性更好；菌株MG-7的耐受性最弱（OD600nm=0.214），與菌株ZX-1的生長量相比降低了約32%。

對12 組不完全正交試驗結果進行直觀分析（表1）可知，影響菌株MG-1和MG-7生長量的主次因素依次為乙醇體積分數＞SO2質量濃度＞pH值；影響菌株QL-11和ZX-1生長量的主次因素依次為乙醇體積分數＞pH值＞SO2質量濃度。

通過復合因素耐受性結果可知，MG-1、MG-7、QL-11、ZX-1對復合脅迫生境的耐受性存在差異，但它們在pH 3.2、乙醇體積分數14%以及SO2質量濃度40 mg/L的培養條件下均可生長增殖，具有良好的發酵耐受性。

3 討 論

本實驗考察4 個發酵因素（pH值、乙醇、SO2質量濃度和發酵溫度）對不同供試菌株的耐受性。其中，在pH值為3.8～4.0的條件下，所有菌株均生長良好；而在3.0～3.5的條件下，菌株生長均受到一定抑制，且pH值越低抑制作用越強。這與Gockowiak等[15]的研究結果一致。Betteridge等[21]也指出，在pH值低于3.5的情況下，O.oeni的生長將會受到抑制。Lonvaud-Funel[22]指出，在pH值高于3.5時，菌株更易存活和生長，而在pH值低于3.0的環境中，幾乎很少有菌株能夠正常生長。然而，這些結果并不是絕對的，因為在葡萄酒復雜多變的環境中各種因素之間會產生相互作用，最終影響O.oeni的生存能力[23]。

乙醇耐受性因菌株而異，O.oeni菌株通常能夠在含有10%乙醇的培養基中生長[15]。實驗證實乙醇對O.oeni生長的影響較大，尤其在乙醇體積分數達到14%時，所有菌株生長量迅速下降，僅菌株ZX-1的OD600nm值可達到0.6左右，表現出良好的耐受性。而在低乙醇體積分數（6%和8%）條件下，所有菌株都具良好的抗性，最低OD600nm保持在0.9以上。這可能是因為乙醇作為細菌細胞膜的干擾因素，能夠破壞細胞膜的完整性，改變細胞膜通透性，從而影響細菌的正常生長，而乙醇體積分數越高對其細胞膜的影響越大[24]。細菌的細胞壁、質膜和代謝途徑是參與其生理變化的主要場所，其目的是確保對乙醇脅迫反應的適應性。了解乙醇對微生物細胞作用的機制，將有助于采取一定措施提高微生物對乙醇的耐受性[25]。

SO2是常用于葡萄酒釀造和其他食品生產中的重要抑菌劑[26]。O.oeni對SO2較為敏感，但不同菌株之間的抗性存在差異。本實驗結果顯示，SO2質量濃度在60 mg/L以下時，菌株均能生長，但在80 mg/L的條件下，菌株生長受到嚴重抑制，尤其在100 mg/L時，幾乎沒有菌株能夠生長，與Maturano等[27]的研究結果一致。同時，也有研究表明，即使在高質量濃度SO2條件下沒有觀察到菌株的生長，但細菌在含有結合態SO2的培養基中仍然具有代謝活性，表明結合態SO2是抑菌而并不能殺菌[28]。此外，根據Wang Shaoyang等[29]的研究結果，在乳酸細菌中，O.oeni是對SO2最敏感的菌株之一。

與其他影響因素相比，溫度對O.oeni影響最小。本實驗中發酵溫度為25 ℃時，所有菌株生長量最高，而16 ℃時生長量雖有所降低，但OD600nm也均在0.8以上，表明所有O.oeni菌株對溫度都具有良好的抗性。葡萄酒中O.oeni菌株最佳生長溫度在20～25 ℃之間，而在15 ℃或更低的溫度下，細菌生長的可能性很小[30]。在干紅葡萄酒釀造過程中較高的發酵溫度會導致葡萄皮中花色苷和單寧的浸出，其中花色苷對O.oeni具有積極的作用，而單寧對O.oeni具有抑制作用，在葡萄酒MLF過程中，一般建議在18～20 ℃條件下進行，以避免發酵緩慢或延滯，對葡萄酒的品質帶來不良影響[31]。

4 結 論

對甘肅河西走廊葡萄酒產區分離鑒定的7 株本土O.oeni菌株進行了發酵耐受性分析。結果表明，同一菌株對pH值、乙醇、SO2質量濃度、發酵溫度等釀造條件的耐受性不同，且菌株之間存在顯著差異（P＜0.05）。釀造單因素結合復合因素耐受性分析證實，菌株ZX-1耐受性最佳，其次為菌株MG-1、MG-7和QL-11。發酵溫度20 ℃、pH 3.5、乙醇體積分數10%和SO2質量濃度20 mg/L為4 株菌的理想生長條件；而在pH值3.2、乙醇體積分數14%及SO2質量濃度40 mg/L的最大脅迫條件下，4 株菌均可生長增殖，且ZX-1株的生長量最大。乙醇是影響菌株生長的最主要釀造因素，此外菌株QL-11和ZX-1對SO2質量濃度的耐受性高于pH值，而菌株MG-1和MG-7對pH值的耐受性高于SO2質量濃度。綜合分析，菌株ZX-1、MG-1、MG-7和QL-11在葡萄酒釀造生境條件下均能夠生長繁殖，具備產業化應用的潛力。