基于C14-HSL探討阪崎腸桿菌中信號分子與其生長機制關系

閆曉彤，羅小娟，潘潔茹，葉海梅，林 侃，李長城，方 婷,

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福州市疾病控制預防中心，福建 福州 350004）

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）作為一種新興的致病菌是在動物與人腸道中寄生的一種無芽孢、兼性厭氧、有鞭毛的桿狀革蘭氏陰性菌[1]。C.sakazakii來源廣泛，在多種食品中均有分離檢出，包括嬰兒食品[2]、生鮮食品[3]、加工食品[4]、草本植物[5]等。同時，C.sakazakii也是一種具有嚴重危害性的食源性致病菌，可能導致敗血癥、腦膜炎和壞死性腸炎等[6-7]，導致可能危及生命的慢性后遺癥[8]，主要發(fā)生在早產(chǎn)兒和免疫功能低下的嬰兒中。但是盡管新生兒感染的問題很突出，C.sakazakii感染也會發(fā)生在成年人群中，尤其是患有嚴重潛在疾病或惡性腫瘤的人群[9]。

許多菌細胞在生長繁殖過程中能夠合成一種具有擴散性的小分子化學物質并滲透到細胞外，隨細菌密度的不斷增大，小分子化學物質的濃度達到臨界閾值，此時細菌通過一種稱為群體感應（quorum sensing，QS）[10-11]的調控機制感應小分子化學物質，并啟動一系列靶基因的表達，從而實現(xiàn)交流過程。細菌分泌毒力因子、產(chǎn)生抗菌素或生物被膜等行為在細菌的生存過程中起著至關重要的作用[12-14]，這些行為都與QS現(xiàn)象密切相關。QS是一種依賴于密度的機制，在繁殖過程中產(chǎn)生的小分子化學物質稱為自體誘導物（autoinducer，AI）[15-16]。N-酰基高絲氨酸內酯（N-acyl-homoserine lactones，N-acyl-HSL，也寫作AHLs）是革蘭氏陰性菌QS中最常見的AI[17]，但通常情況下細菌所產(chǎn)生的N-acyl-HSL物質含量極低，對該物質的檢測存在一定困難，UPLC-MS/MS技術就是一種檢測AHLs類AI的一種有效手段[18]，高效液相色譜-串聯(lián)質譜法是檢測液體AHLs信號分子最快速并可靠的方法[19]。目前，已有研究通過信號分子探討AHLs與其生物被膜形成的關系[20]，根據(jù)菌QS信號分子的產(chǎn)生探討其對食品腐敗的影響[21]。據(jù)報道，細菌產(chǎn)生的信號分子等物質與遺傳、環(huán)境因素一起參與了細菌生物膜的形成[22]，而細菌的生物膜對于抗菌藥物和宿主防御體系具有天然的抵抗力[23]，如紫外線、滲透壓力、高溫、抗生素、吞噬細胞和噬菌體等[24]。因此，本研究通過對不同時間段C.sakazakii所合成的C14-HSL信號分子實際檢測結果，結合預測微生物模型，追蹤C.sakazakii生長周期中AI的生長動態(tài)，為進一步闡述該菌的生長機制提供新的思路。預測微生物學屬于應用食品科學領域，該學科應用數(shù)學模型預測食品在加工、運輸、分配以及貯藏過程中經(jīng)歷復雜的物理、化學以及生物變化后微生物的生長與存活情況[25]。預測模型可以用來評估食品加工的風險，通過預測致病菌與腐敗菌的行為從而實施控制措施以保證食品的安全性。作為一個新興領域，預測微生物學已成為預測食品保質期、質量控制以及風險評估的有用工具[26]。目前已開發(fā)出多種用于描述細菌生長的不同類別的預測微生物模型，IPMP（Integrated Pathogen Modeling Program）多應用于病原菌的生長模型，是美國農(nóng)業(yè)部開發(fā)的預測細菌生長的模型軟件，使用者輸入酸堿度、溫度、水分活度等影響細菌生長的因素以及初始菌數(shù)，即可獲得細菌生長曲線以及生長的重要條件和生長數(shù)據(jù)。

本研究選用C.sakazakiiCICC21550菌株為研究對象，通過測定C.sakazakii生長過程中產(chǎn)生的C14-HSL信號分子濃度的變化，將IPMP 2013程序引入C.sakazakii的QS研究中，結合宏觀生長預測模型，探究C.sakazakii的生長機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株C.sakazakiiCICC21550購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保存于液氮罐中。Agrobacterium tumefaciensNTL4（pZLR4）是人工誘導的突變菌株，含有pZLR4質粒，在培養(yǎng)過程中需添加50 μg/mL的慶大霉素，但在檢測實驗中不添加。該菌主要用來初步驗證實驗菌株是否能夠合成長酰基側鏈的AHLs。A.tumefaciensNTL4 （pAoF64/95trac）自身能夠產(chǎn)生AHLs類信號分子，誘導靶基因表達，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，所以檢測過程中該菌應用于傳感菌A.tumefaciensNTL4（pZLR4）的陽性對照。這2 株根癌農(nóng)桿菌均由Stephen K.Farrand教授（美國伊利諾伊大學）饋贈。

C.sakazakii的活化與生長實驗使用Luria-Bertani（LB）肉湯，每升含酵母膏粉5 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、最終pH 7.0±0.2；C.sakazakii單菌落保存于結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）中，每升含氯化鈉5.0 g、3號膽鹽1.5 g、葡萄糖10.0 g、蛋白胨7.0 g、中性紅0.03 g、酵母提取物3.0 g、結晶紫0.002 g、瓊脂12 g、最終pH 7.4±0.2 福州市伯樂林生物科技有限公司；1‰的蛋白胨培養(yǎng)基（peptone water，PW） 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。各培養(yǎng)基在使用之前均使用高壓蒸汽滅菌鍋于121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后使用。

C14-HSL、X-Gal、慶大霉素 美國Sigma公司；乙酸乙酯、氯化氫等均為分析純。

1.2 儀器與設備

Aquity超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用儀 美國Waters公司；SP-2300A2光吸收型全波長酶標儀 上海閃譜生物有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療機械廠；SW-CJ-2D微生物用超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DHP-500W電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器 江蘇太倉實驗設備廠；H-1850R高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SHP-250低溫生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；QL-866渦旋振蕩器 海門市其林貝儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將菌株C.sakazakiiCICC21550從保種管中取出，劃線于VRBGA上進行隔夜活化。將活化后的單菌落利用無菌接種環(huán)轉移至10 mL的新鮮LB肉湯中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)（130 r/min）過夜，使其恢復生長。之后，菌懸液在4 ℃條件下利用離心機使菌細胞與培養(yǎng)液分離，其中轉速為5 000 r/min，時間10 min。用10 mL的PW重懸菌細胞洗去其表面毒素，再次重復上述離心過程，棄去上清液。重復洗菌步驟1 次后，用10 mL的1‰ PW重懸菌細胞，混勻，用1‰ PW將菌液進行梯度稀釋至102～103CFU/mL，備用。

1.3.2 生長實驗與計數(shù)

將LB肉湯分裝于各試管中（10 mL/管），于121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻至室溫后使用。將0.1 mL前述所備好的C.sakazakiiCICC21550菌懸液分別接種至各試管中，于37 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按一定時間間隔取樣測定C.sakazakii菌數(shù)。每個條件下細菌的生長曲線至少需要10 個以上的取樣點。在測定菌落數(shù)時，將樣液利用已滅菌的1‰ PW進行適當?shù)奶荻认♂尯笸坎加赩RBGA中，每個平板作2 個平行。將涂布好的平板37 ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。實驗至少重復2 次，每次實驗采用不同批次的C.sakazakii菌懸液。

1.3.3C.sakazakiiAHLs信號分子的生物鑒定

實驗前一天，使用無菌接種環(huán)分別挑取固體培養(yǎng)基中C.sakazakiiCICC21550、A.tumefaciensNTL4（pZLR4）、A.tumefaciensNTL4 （pAoF64/95trac）的單菌落至10 mL的LB肉湯中，于28 ℃的恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)18 h，轉速130 r/min。取3 支試管分別編號1、2、3：

試管1：作為陽性對照，分別添加A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液30 μL、X-Gal（50 mg/mL）的二甲基甲酰胺溶液20 μL、A.tumefaciensNTL4（pAoF64/95trac）菌液30 μL、LB肉湯3 mL；試管2：作為陰性對照，分別添加A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液30 μL、X-Gal（50 mg/mL）的二甲基甲酰胺溶液20 μL、LB肉湯3 mL；試管3：作為實驗組，分別添加A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液30 μL、X-Gal（50 mg/mL）的二甲基甲酰胺溶液20 μL、C.sakazakiiCICC21550菌液30 μL、LB肉湯3 mL。所有實驗均作2 次平行，各試管于28 ℃的恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)24 h，觀察顏色變化。

1.3.4 不同生長階段C.sakazakiiAHLs粗提液的制備

C.sakazakiiCICC21550菌株按一定時間間隔培養(yǎng)不同時間后，通過離心將菌細胞與培養(yǎng)液分離，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液。添加適量的NaCl于上清液中，搖勻，用400 mL乙酸乙酯萃取上清液，使AHLs信號分子充分溶解于乙酸乙酯中，分離兩相并收集有機相。同樣步驟繼續(xù)萃取2 次，混合2 次萃取的有機相后添加適量的無水硫酸鎂除去殘留水相，抽濾分離，利用旋轉蒸發(fā)儀于30 ℃的條件下蒸干溶劑，用甲醇溶解附著于旋蒸瓶內壁的AHLs信號分子粗提物，定容至5 mL，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 不同生長階段C.sakazakiiAHLs活性的檢測

利用β-半乳糖苷酶法檢測不同生長階段C.sakazakiiAHLs信號分子的活性。首先，使用無菌接種環(huán)挑取LB瓊脂培養(yǎng)基中A.tumefaciensNTL4（pZLR4）單菌落至10 mL的LB肉湯中，于28 ℃過夜活化2 次后，將A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液稀釋至OD600nm為0.5備用。分裝上述菌液至高壓滅菌后的離心管中（10 mL），分別將不同生長階段下C.sakazakiiAHLs粗提液100 μL添加至含A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液的各離心管中，于28 ℃培養(yǎng)6～8 h至OD600nm為1.0。β-半乳糖苷酶活性根據(jù)Miller等[27]的方法進行檢測。每個生長階段下C.sakazakiiAHLs活性的檢測均作3 次平行，結果以±s表示。

1.3.6 UPLC-MS/MS定量檢測C.sakazakiiC14-HSL信號分子

色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫為35 ℃；分析時間7 min；進樣體積為5 μL；流速為200 μL/min；流動相：A為甲醇，B為5 mmol/L含有0.1%甲酸的乙酸銨溶液。梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

質譜條件：采用電噴霧離子源，多反應離子監(jiān)測；應用正離子掃描模式；離子源溫度為150 ℃；毛細管電壓為3.0 kV；載氣為氮氣，其流速為800 L/min；應用氬氣為碰撞氣，流速為0.2 mL/min。

1.3.7 數(shù)據(jù)擬合與模型建立

軟件IPMP 2013是一種界面友好型的綜合數(shù)據(jù)分析工具，由美國農(nóng)業(yè)部東部地區(qū)研究中心開發(fā)而得。該軟件操作簡單，不需用戶掌握復雜的編程知識，圖1為IPMP 2013軟件的工作界面，分析數(shù)據(jù)時只需將實驗數(shù)據(jù)輸入并選擇相應模型即可獲得數(shù)據(jù)擬合曲線以及數(shù)據(jù)分析報告。

本實驗采用Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型分別擬合37 ℃C.sakazakiiCICC21550在LB液體培養(yǎng)基中的生長數(shù)據(jù)以及同溫度不同時間條件下C14-HSL信號分子的濃度數(shù)據(jù)，建立37 ℃條件下C.sakazakiiCICC21550生長的一級動力學模型及C14-HSL信號分子的擬合模型。此外，結合C.sakazakiiCICC21550生長的一級動力學模型及模型擬合參數(shù)，進一步從微觀角度（C14-HSL信號分子的擬合模型）探究C.sakazakii的生長機制。

圖1 IPMP 2013的圖形用戶界面Fig.1 Graphical user interface of IPMP 2013

2 結果與分析

2.1 A.tumefaciens NTL4（pZLR4）檢測AHLs信號分子

在提取C.sakazakiiAHLs信號分子之前，利用A.tumefaciensNTL4（pZLR4）生物傳感菌再次驗證C.sakazakiiCICC21550能夠產(chǎn)生AHLs類AI。如圖2所示，在底物X-Gal的存在下，C.sakazakiiCICC21550能使生物傳感菌A.tumefaciensNTL4（pZLR4）產(chǎn)生藍綠色反應。該顏色的產(chǎn)生表明C.sakazakiiCICC21550能夠合成AHLs類AI。

圖2 A.tumefaciens NTL4（pZLR4）對AHLs信號分子的生物鑒定Fig.2 Bioassays with A.tumefaciens NTL4 (pZLR4) for detection of AHLs signal molecules

2.2 不同生長階段C.sakazakii AHLs活性的變化

A.tumefaciensNTL4（pZLR4）含pZLR4質粒，在外源酰基長鏈AHLs存在時誘導產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，水解X-Gal產(chǎn)生藍綠色。當外源N-酰基高絲氨酸內酯信號分子的濃度越大，A.tumefaciensNTL4（pZLR4）所表達的β-半乳糖苷酶的活性越強，因此，通過檢測反應體系中β-半乳糖苷酶的活性變化在一定程度上可間接反映N-酰基高絲氨酸內酯信號分子的含量多少。如圖3所示，C.sakazakiiCICC21550生長期間AHLs的活性檢測表明，不同培養(yǎng)時間下C.sakazakiiCICC21550所合成的AHLs的活性存在差異。此外，AHLs的活性隨細菌細胞密度的增大而增大，具有密度依賴性，當細菌細胞生長達最大值（18 h）時，C.sakazakiiCICC21550所合成的AHLs的活性達最大，隨后細菌細胞的生長繁殖處于穩(wěn)定期甚至衰亡期，C.sakazakii所合成的AHLs的活性逐漸下降。

圖3 C.sakazakii CICC21550生長期間AHLs活性與菌落數(shù)的關系Fig.3 Relationship between AHL activities and bacterial counts during the growth of C.sakazakii CICC21550

2.3 37 ℃條件LB液體培養(yǎng)基中C.sakazakii的生長擬合曲線

圖4 37 ℃條件下LB中C.sakazakii生長的一級擬合曲線Fig.4 Growth curves fitted to different primary models of C.sakazakii in LB medium at 37 ℃

表2 37 ℃條件下LB中C.sakazakii的一級模型擬合參數(shù)Table 2 Parameters of different primary models for C.sakazakii growth in LB medium at 37 ℃

Huang模型、Baranyi模型以及Gompertz模型的擬合參數(shù)AIC以及RMSE數(shù)值越小表示數(shù)據(jù)在模型中的擬合度越高。結合模型擬合曲線（圖4）可發(fā)現(xiàn)，Huang模型及Baranyi模型具有較高的擬合度。此外，根據(jù)擬合參數(shù)（表2），Huang模型的AIC以及RMSE數(shù)值均小于Baranyi模型與Gompertz模型。由此可見，Huang模型是37 ℃條件下C.sakazakiiCICC21550在LB培養(yǎng)基中生長的最佳擬合模型。

2.4 37 ℃條件下C.sakazakii的生長過程中C14-HSL濃度變化的擬合曲線

圖5 37 ℃條件下C.sakazakiiC14-HSL的一級模型擬合曲線Fig 5 Curves of C14-HSL secreted by C.sakazakii at 37 ℃ againstbacterial growth time fitted to different primary models

表3 37 ℃條件下C.sakazakiiC14-HSL的一級模型擬合參數(shù)Table 3Parameters of different primary models for C14-HSL secreted by C.sakazakii at 37 ℃

為進一步從微觀角度探究C.sakazakii的生長機制，根據(jù)UPLC-MS/MS定量檢測AHLs的方法，檢測不同培養(yǎng)時間條件下C.sakazakiiCICC21550所合成的C14-HSL信號分子的濃度，應用Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型擬合C14-HSL濃度數(shù)據(jù)，擬合曲線如圖5所示。C14-HSL信號分子的濃度隨C.sakazakiiCICC21550的生長具有一定規(guī)律性，呈先上升后下降的趨勢。根據(jù)模型擬合參數(shù)（表3），Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型對C14-HSL均具有較好的擬合度，各擬合模型曲線具有明顯的遲滯期。其中，Baranyi模型的RMSE和AIC的值分別為0.268和-16.449；Huang模型的RMSE和AIC的值分別為0.238和-19.356；Gompertz模型的RMSE和AIC的值分別為0.376和-8.345。當RMSE和AIC的值越小說明曲線的擬合性越好，所以由以上數(shù)據(jù)可知Baranyi模型可以很好的模擬37 ℃條件下C.sakazakii的生長過程中C14-HSL濃度變化的曲線。通過Baranyi模型擬合得到的C14-HSL信號分子的最大濃度Ymax的值為8.535，最大生成速率μmax的值為0.825。

可見，IPMP程序不僅適用于細菌生長的模型擬合，對于微觀角度細菌QS的AI模型擬合同樣適用。此外，結合37 ℃ LB液體培養(yǎng)基中C.sakazakii的生長擬合模型，對比表2與表3的擬合參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)C14-HSL信號分子的產(chǎn)生與細菌的生長存在正相關，并且C14-HSL信號分子產(chǎn)生的遲滯期明顯比C.sakazakiiCICC21550細菌生長的遲滯期長，可見細菌QS系統(tǒng)的啟動要建立在細菌生長適應環(huán)境之后的基礎上。劉國榮等[28]在分析菌體密度和細菌素合成的相關性時表明，當菌體細胞達到活菌數(shù)為7.31（lg（CFU/mL））時，細菌素才開始合成。發(fā)酵過程中，菌體密度與細菌素的合成呈現(xiàn)正相關性。朱軍莉等[29]研究表明，大黃魚在4 ℃貯藏初期表現(xiàn)出AI-2信號分子活性，隨著貯藏時間的延長，細菌的增殖，AI-2信號分子強度也逐漸增加。李燦等[30]對凡納濱對蝦中優(yōu)勢腐敗菌的QS信號分子測定表明，AHLs活性與菌體生長密度呈正相關，AI-2產(chǎn)生量在菌體生長對數(shù)期累積，在菌體生長24 h后活性迅速減弱。這些研究都進一步表明，調節(jié)細菌QS現(xiàn)象的信號分子與細菌的密度存在正相關關系，QS現(xiàn)象發(fā)生在細菌密度達到一定數(shù)值的基礎之上，進一步驗證，細菌QS系統(tǒng)的啟動可能要建立在細菌生長適應環(huán)境之后的基礎上。

3 結 論

本實驗主要探究C.sakazakii生長過程中C14-HSL信號分子的合成規(guī)律，利用IPMP程序建立了阪崎腸桿菌數(shù)量、C14-HSL信號分子與時間的關系，追蹤C.sakazakii生長周期中AI的生長動態(tài)，結合細菌生長的宏觀模型，為進一步闡述該菌的生長機制提供新的思路。結果表明：1）C.sakazakiiCICC21550在對數(shù)生長初期就有檢出C14-HSL信號分子，在細菌生長的穩(wěn)定期達最大值，隨后呈逐漸下降趨勢，具有明顯的密度依賴性。通過Baranyi模型擬合得到的C14-HSL信號分子的最大濃度Ymax的值為8.535，最大生成速率μmax的值為0.825。2）IPMP程序不僅適用于細菌生長的模型擬合，對于微觀角度細菌QS的AI模型擬合同樣適用。Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型等一級模型對C14-HSL均具有較好的擬合度，各擬合模型曲線具有明顯的遲滯期，且遲滯期明顯比細菌生長的長。