北京棒桿菌新型天冬氨酸激酶雙突變株Y198N/D201M的構建及酶學性質表征

魏 貞，韓彩靜，高云娜，樊占青，王亞南，王哲人，閔偉紅

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

北京棒桿菌天冬氨酸激酶（Corynebacterium pekinenseaspartate kinase，CpAK）是一種新型的單體別構酶[1]，受蘇氨酸（Thr）和賴氨酸（Lys）的協同反饋抑制[2]，致使天冬氨酸族氨基酸難以大量積累。與北京棒桿菌不同的是，AK在其他生物體內有不同的存在形式和抑制機制，擬南芥（Arabidopsis thaliana）含有3 種單功能AK（AKI、AKII和AKIII）和2 種雙功能AKHSDH（I和II）[3-4]，其中AKI受Lys和甲硫氨酸（Met）的抑制[5-7]；大腸桿菌中含有1 種單功能AKIII和2 種雙功能AK-HSDHI、AK-HSDHII[8-9]，AK-HSDHI受Thr抑制[10]，AK-HSDHII受L型Met阻遏，而AKIII受Lys抑制[11]。谷氨酸棒桿菌AKII以協同方式被Lys和Thr抑制[12]。

由于AK在代謝途徑中受協同反饋調節，因此通過解除反饋抑制提高下游代謝產物產量成為研究熱點。目前對AK的改造主要通過質粒重組[13-14]、基因敲除[15]、定點突變[16-19]等方式進行，其中定點突變技術應用較普遍。Chen Zhen等[16]分析了谷氨酸棒桿菌AK調節域中的關鍵性殘基位點，利用定點突變技術對酶定向改造，從而削弱了Thr和Lys的協同反饋抑制作用。也有研究篩選出谷氨酸棒桿菌AK中抑制劑結合位點和底物結合位點周圍的關鍵殘基，獲得了解除Lys和Thr反饋抑制且酶活力提高的突變株R169Y、R169P、T379L和A380I，為優化AK代謝途徑和構建多突變體優良菌株提供參考和依據[1,17-18]。

目前對CpAK的改造主要集中在抑制劑位點[18-23]，對其底物結合位點和ATP結合位點的改造鮮有文獻報道。AK催化反應機理是將ATP的磷酸基團轉移到底物使底物磷酸化，因此ATP對酶活性具有重要作用[24]。Li Changcheng等[25]報道在銅綠假單胞菌AK中對ATP結合位點進行雙突變，D182/R184A酶活力降低到60%，證明ATP結合口袋對酶活力有重要影響。本研究選取ATP周圍的關鍵位點Tyr198和Asp201，對其進行定點飽和突變，采用高通量篩選獲得酶活力提高并解除反饋抑制的突變株，以期為解除AK反饋抑制提供可參考的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組大腸桿菌（pET-28a-AK/BL21）由吉林農業大學發酵工程實驗室提供；大腸桿菌BL21（DE3） 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

質粒抽提試劑盒、Taq酶、核酸電泳Marker、DpnI酶大連TaKaRa公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；非變性鎳柱及柱料 美國GE公司；引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

LB液體培養基：1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母浸粉，溶解于去離子水后，用2 mol/L NaOH溶液調pH值至中性，121 ℃滅菌20 min；LB固體培養基在此基礎加1.8%瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司； Spectra Max 190酶標儀美國Molecular Devices公司；超聲破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；Z36HK低溫高速離心機 德國Hermle公司；蛋白印記轉膜儀 美國Bio-Rad公司；SE260蛋白電泳儀、瓊脂糖凝膠成像儀 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計及定點飽和突變

利用Primer 5.0軟件對位點進行設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，雙突變體上游引物F-y198n/d201m：5’-CGGCATAGCGGTATTCACACCGT CAACG-3’；下游引物R-y198n/d201m：5’-CGTTGACG GTGTGAATACCGCTATGCCGC-3’。按照說明書提取質粒pET-28a-AK，以pET-28a-AK為模板對其進行全質粒擴增，反應條件：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min，18 個循環，72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.2 擴增產物消化及轉化

1.3.1 節中PCR產物經1%瓊脂糖核酸電泳驗證成功后用DpnI酶消化，反應體系為PCR產物2 μL、10×T Buffer 2 μL、DpnI酶0.3 μL、ddH2O 15.7 μL，37 ℃水浴2 h。

取1～2 μL消化產物加入BL21感受態細胞，冰浴30 min，42 ℃熱激42 s，再冰浴5 min后加入800 μL LB液體培養基，37 ℃、180 r/min振蕩培養2 h，6 000 r/min離心5 min，棄700 μL上清液，將剩余上清液與菌體吹打混勻后涂布LB固體培養基，37 ℃過夜培養。

1.3.3 突變株高通量篩選及AK基因驗證

挑取單菌落于LB液體培養基（含50 μg/mL卡那霉素）中擴大培養，加入終濃度為1 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導表達后進行高通量篩選，方法見文獻[20]，選取酶活力提高較高的突變株于5 mL LB液體培養基擴大培養，37 ℃、180 r/min培養12 h。以菌液為模板，用克隆引物進行PCR擴增，反應體系及條件見文獻[26]，PCR產物經1%瓊脂糖核酸電泳驗證，驗證成功的菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 AK誘導表達及蛋白純化

菌株活化后以2%接種量轉入100 mL LB液體培養基擴大培養，加入誘導劑IPTG（終濃度1 mmol/L）誘導8 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄去上清液收集菌體。粗酶液制備方法及純化方法參照文獻[23]，粗酶液和純化液經SDS-PAGE和Western blot進行驗證，實驗步驟參考文獻[1]。

1.3.5 AK活力測定及動力學分析

反應速率V定義為1 min內1 mg酶的催化能力，單位為U/（mg·min），其中1 mL酶活力測定反應體系參考文獻[18]，在反應體系其他條件不變的情況下，改變底物濃度（分別為0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L）于540 nm波長處測其吸光度，并計算AK比活力，通過Origin 8.5軟件中的Hill方程V=VmaxSn/（Kn＋Sn）進行非線性擬合。

1.3.6 AK酶學性質分析

1.3.6.1 最適溫度

反應體系不變的情況下，在不同溫度（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50 ℃）反應30 min，每組樣品3 次平行，最高酶活力定義為100%。

1.3.6.2 最適pH值

反應體系不變的情況下，調節反應體系中Tris-HCl緩沖液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0），每組樣品3 次平行，最高酶活力定義為100%。

1.3.6.3 穩定性

在最適溫度和最適pH值下，將AK純化酶液加入反應體系中反應30 min后測定酶活力，此時酶活力定義為100%，以后每隔1 h檢測酶活力，每組樣品3 次平行。

1.3.6.4 底物抑制劑對AK活力的影響

在反應體系中加入不同底物抑制劑Lys、Thr、Met、Lys＋Thr、Lys＋Met、Thr＋Met、Lys＋Thr＋Met（終濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L），以檢測抑制劑對AK活力的影響，每組樣品3 次平行，不添加底物抑制劑的對照組相對酶活力定義為100%。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 ATP結合位點的篩選

采用Clustal X 1.81進行同源序列比對，比對結果用軟件ESPript 3.0進行修飾，并利用PyMOL軟件對AK模型進行分析，Tyr198位點和Asp201位點均為保守位點且位于ATP周圍，如圖1A、B所示。在前期研究基礎中，對CpAK突變體A380I利用Gromacs軟件進行動力學模擬（53A6力場描述蛋白質和配體，配體參數由PRODRG2.5服務器提供），通過分子動力學模擬，發現殘基Tyr198與ATP之間的氫鍵占有率增加，其中ATP∶N5與Tyr198∶O之間氫鍵占有率由42.48%增加到54.35%，Tyr198∶CD1與ATP∶C10之間氫鍵占有率由0%增加到31.97%，從而與ATP交互作用增強，因此推測Tyr198位點是ATP周圍的關鍵位點[1]。通過模型空間結構比對（圖1C），CpAK Asp201位點對應于甲烷球菌AK（Methanococcus jannaschiiAK，MjAK）（PDB：2hmf）Asp239位點，而MjAK Asp239位點參與催化反應。設想Asp201位點對于酶活力提高有重要作用[27]。因此在本研究中選取Tyr198和Asp201位點作為定點飽和突變位點。

圖1 ATP結合位點的篩選Fig.1 Selection of ATP binding sites

2.2 突變體構建

以質粒pET-28a-AK為模板，在Y198N/D201M的引物作用下進行定點飽和突變PCR擴增，如圖2A所示，在7 000 bp附近有條帶，初步證明突變成功。PCR產物經消化酶DpnI處理后導入到大腸桿菌感受態細胞中，通過高通量篩選獲得高AK活力菌株，對菌液進行PCR驗證，在1 000～2 000 bp之間有單一明顯條帶，其與目的基因CpAK長度1 266 bp相符，表明目的基因AK實現了大量復制（圖2B）。測序結果如圖2C所示，AK氨基酸序列中198位點由Tyr突變成Asn，201位點由Asp突變成Met，即表明雙突變體Y198N/D201M構建成功。

圖2 突變體Y198N/D201M的構建Fig.2 Construction of mutant Y198N/D201M

2.3 SDS-PAGE和Western blot驗證

圖3 SDS-PAGE（A）及Western blot（B）結果Fig.3 Results of SDS-PAGE (A) and Western blot (B)

對WT和突變體菌株分別進行誘導表達及非變性鎳柱純化，將獲得的AK粗酶液和AK純化液進行SDS-PAGE及Western blot電泳驗證，結果如圖3所示。在48 kDa左右處均有明亮單一條帶，表明AK蛋白在誘導劑IPTG的作用下成功表達。

2.4 反應動力學分析

圖4 WT和Y198N/D201M的動力學分析Fig.4 Kinetic analysis of WT and mutant Y198N/D201M

表1 WT AK及Y198N/D201M動力學參數Table 1 Kinetic parameters of WT AK and mutant Y198N/D201M

單體AK的反應動力學符合Hill方程V=VmaxSn/（Kn＋Sn），是典型的別構酶。Km值表示酶促反應的初速率為最大速率Vmax一半時的底物濃度，單位一般為mmol/L或者μmol/L，Km只與酶的性質有關，而與酶濃度無關。Vmax表示在一定酶量下的最大反應速率，即酶完全被底物飽和時的反應速度，與酶濃度呈正比[28]。n值表示希爾系數，代表協同性，其中n＜1表示負協同反應：一旦一個配體分子結合到酶上，酶對其他配體的親和力就會減小；n=1表示非協同反應：酶對于一個配體分子的親和力并不取決于是否有配體分子已結合到其上；n＞1表示正協同反應：一旦一個配體分子結合到酶上，酶對其他配體的親和力就會增大[29]。

對WT和突變體AK純化液分別進行酶促反應動力學分析，結果如圖4和表1所示。WT AKn值為1.91，表明AK呈正協同性，突變體Y198N/D201M AK的n值為1.58，n值降低，表明突變后AK的正協同性降低；突變后AK的Km值由3.58 mmol/L降至2.37 mmol/L，表明突變使得AK與底物親和力增強；Y198N/D201M AK的Vmax為65.19 U/（mg·min），較WT AKVmax（3.57 U/（mg·min））提高到18.26 倍。

2.5 酶學性質表征

2.5.1 溫度對AK活力的影響

由圖5A可知，WT AK最適溫度為25 ℃，突變體Y198N/D201M AK最適溫度為28 ℃，突變后最適溫度提高3 ℃，說明突變有效改善了AK的最適溫度。WT AK溫度敏感性高，可適溫度區間較小，當溫度高于35 ℃時，AK活力急劇下降，而突變體Y198N/D201M AK在15～45 ℃溫度范圍內，相對酶活力仍保持在55%以上，說明突變后酶耐高溫性能增強。

圖5 WT和Y198N/D201M的酶學性質表征Fig.5 Enzymatic properties of WT and mutant Y198N/D201M

2.5.2 pH值對AK活力的影響

由圖5B可知，WT AK最適pH值為8.0，突變后AK最適pH值由8.0降低至7.5，同時，耐受pH值區間也變廣，在pH 6.5～8.5范圍內相對酶活力保持在70%以上，這將有利于菌株氨基酸發酵生產。

2.5.3 AK穩定性

在最適溫度和最適pH值的基礎上，測定酶的穩定性，如圖5C所示。WT AK的半衰期為4.66 h，而Y198N/D201M AK的半衰期為5.32 h，較WT AK延長了0.66 h。在6 h時，突變體保持40%酶活力，直到10 h酶活力仍保持在20%以上，顯著高于WT AK（6 h時約保持20%酶活力，10 h時酶活力不到10%），表明突變體AK穩定性更好。

2.5.4 底物抑制劑對AK活力的影響

表2 不同底物抑制劑條件下WT和Y198N/D201M的相對酶活力Table 2 Relative activity of WT and mutant Y198N/D201M in the presence of different substrate inhibitors%

從表2可知，WT AK受Lys和Thr反饋抑制，隨抑制劑Lys或Thr濃度的增加抑制作用逐漸增強，當抑制劑Lys或Thr濃度為10 mmol/L時，WT AK的相對酶活力分別為40.60%和44.47%，抑制率分別約為60%和55%。當Met單獨存在時，對酶的抑制作用較弱，抑制率為20%～30%。當2 種抑制劑同時存在時，Lys＋Thr抑制率最強達到約72%，Lys＋Met或Thr＋Met最大抑制率約為48%和40%，說明AK主要受Lys和Thr的抑制，這與文獻報道一致[30]。當3 種抑制劑同時存在時，最大抑制率約為62%。突變后，在不同濃度抑制劑存在下，突變體Y198N/D201M AK均被明顯激活，特別是在10 mmol/L的Lys＋Met、Thr＋Met、Lys＋Thr＋Met存在時，Y198N/D201M AK相對酶活力分別為117.67%、113.80%和115.66%，除5 mmol/L的底物抑制劑Lys＋Thr＋Met外，AK激活作用隨著抑制劑濃度增大而增強，呈現明顯的劑量依賴關系。這與動力學數據結果（Km和n值減小，Vmax增大）一致，亦說明本研究選取的Tyr198和Asp201為影響酶活力的關鍵位點。

3 討 論

張芷睿等[22]對CpAK抑制劑結合位點Gln316位點進行突變，突變體Q316P較WT提高8.53 倍，并通過軟件分析發現突變后抑制劑對AK抑制作用減弱，但未對突變株酶活力提高機制進行探討。Min Weihong等[17]對CpAK通過虛擬篩選得出R169是一個抑制劑結合、底物結合和催化反應的重要位點，因此通過定點飽和突變對其進行改造，其中R169Y酶活力提高4.71 倍，亦未對突變株酶活力提高機制進行探討。Han Caijing等[1]對抑制劑結合位點A380進行突變，獲得了酶活力提高11.32 倍的突變株A380I，用分子動力學模擬探討突變株酶活力提高機制：對抑制劑結合位點突變后能通過別構調控調節酶與ATP親和力，其中Tyr198與ATP之間的氫鍵占有率增加，親和力增強。本實驗在Han Caijing等[1]研究基礎上，對ATP結合關鍵殘基位點Tyr198及催化位點Asp201進行定點飽和突變成功篩選獲得酶活力提高到18.26 倍的雙突變株，較對抑制劑結合位點的突變，酶活力顯著提高。對抑制劑結合位點突變后，AK通過別構調控影響酶與ATP親和力，從而調節酶活力，說明ATP結合位點對酶活力提高具有重要作用，因此本研究對ATP結合位點進行突變，通過實驗驗證其酶活力提高較大，進一步說明ATP結合位點的重要性，與Han Caijing[1]和Li Changcheng[25]等報道一致。

圖6 突變前后ATP與Asp之間的變化Fig.6 The change between ATP and Asp before and after the mutation

文獻報道對抑制劑結合位點進行突變，能有效減弱抑制劑的抑制[17-23]，而在本研究中對ATP結合位點突變后對抑制劑有不同程度減弱甚至在高濃度下有激活作用。這可能是由于對ATP結合位點突變后引起了ATP結合口袋重排，致使底物Asp與ATP連接更緊密，由弱的范德華力轉變成更強的作用力（圖6A、B），穩定了底物Asp的結合，從而與AK相互作用增強，動力學結果表明Km由WT的3.58 mmol/L減少到2.37 mmol/L，與上述結論相符。抑制劑Lys是底物Asp的競爭性抑制劑[19]，當底物Asp與AK相互作用增強時，抑制劑Lys不足以與底物Asp競爭，從而減弱了抑制劑的抑制，所以由Lys參與的抑制劑組合下激活作用較明顯，這與表1數據相符。AK作為一個別構酶，對ATP結合位點的突變如何調控抑制劑Lys的結合，從而減弱反饋抑制，仍需要進一步研究。

推測突變體Y198N/D201M酶活力提高的原因可能是：1）Y198位點由環狀氨基酸突變后不含環，可能消除了Tyr與ATP之間雜環的排斥作用，突變后兩者之間的作用力變強（圖6C、D）；2）D201位點由酸性氨基酸（D）突變成非極性氨基酸（M），側鏈殘基變長，與ATP接觸面積增大能更好地催化ATP（圖6C、D）；3）突變后致使底物Asp與ATP的連接更緊密，易于催化反應的進行。

4 結 論

本研究對北京棒桿菌中AK基因Tyr198和Asp201位點進行定點飽和突變，并通過高通量篩選成功獲得酶活力顯著提高的AK雙突變體Y198N/D201M。酶動力學結果顯示：突變體Y198N/D201M AK的Vmax較WT AK提高到18.26 倍，且增強了其與底物Asp的親和力。酶學性質研究表明：Y198N和D201M突變使得AK最適反應溫度由25 ℃增至28 ℃，最適pH值由8.0降至7.5，半衰期由4.66 h延長至5.32 h，表現出較好的穩定性；同時，解除底物抑制劑Lys＋Met、Thr＋Met、Lys＋Thr＋Met對AK活力的反饋抑制作用，為優化AK在棒桿菌代謝途徑中的作用提供參考和依據。