嗜熱甘露聚糖酶manBK基因密碼子優化表達及在魔芋聚糖降解中的應用

盧海強，谷新晰，袁巧敏，談蘇慧，田洪濤

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是β-1,4-甘露聚糖水解酶的簡稱，它可以對甘露聚糖分子主鏈的內部隨機水解β-1,4-甘露糖苷鍵，在食品加工領域具有廣泛的應用前景[1-3]。甘露寡糖是由2～10 個甘露糖殘基通過β-1,4-糖苷鍵聚合而成的低聚糖，屬于益生元[4]。近年來，生物酶解制備甘露寡糖技術應運而生，魔芋富含葡甘露聚糖，其水溶液呈高黏度，致使無法靠增大底物濃度方式提高酶法制備甘露寡糖效率，極大限制了甘露寡糖工業化生產的發展[5-6]。研究發現葡甘露聚糖溶液黏度值隨溫度升高而降低，因此嗜熱甘露聚糖酶在魔芋聚糖深加工中具有巨大應用潛力。

嗜熱酶是一類最適溫度為60 ℃以上的酶，主要從嗜熱微生物中獲得[7]。迄今為止，人們已成功獲得了數十個嗜熱甘露聚糖酶[8-9]。Thu等[10]從黑曲霉中純化獲得了甘露聚糖酶ManBK01，該酶最適反應溫度為80 ℃，屬于嗜熱酶。Do等[11]將該基因進行了異源表達及性質測定研究。由于嗜熱甘露聚糖酶ManBK巨大的應用潛力，Huang Jianwen等[12]對ManBK酶進行了晶體結構的解析，探究了結構與功能的關系。目前，關于提高該酶表達量及提升酶穩定性的相關研究鮮有報道，而上述問題的解決有利于ManBK酶在食品工業中的推廣應用。

巴斯德畢赤酵母pPIC9K表達系統具有許多優點，如高細胞密度、高表達量、易于遺傳操作、復雜的翻譯后修飾能力以及較低的內源基因分泌表達，這使得該系統成為目前最成熟的真核表達系統之一[13-14]。為進一步提升基因的異源表達，已經在巴斯德畢赤酵母中應用了許多方法，如增加基因的拷貝數、選擇合適的信號肽、高效轉錄啟動子和細胞培養的優化[15-17]，其中，將基因進行密碼子優化是提高基因表達量的最有效方法[18]。

因此，本研究通過對嗜熱甘露聚糖酶manBK基因密碼子優化及工程菌產酶條件研究，探究提升ManBK酶表達的策略；通過對嗜熱酶酶學性質的分析，探討金屬離子對酶穩定性影響及魔芋聚糖酶解產物的抗氧化性性能，旨在為ManBK酶在魔芋深加工行業中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴斯德畢赤酵母GS115菌株和質粒pPIC9k由本實驗保存；魔芋聚糖（純度＞95%） 合肥博美生物技術有限公司；大腸桿菌感受態細胞TransI-T1 北京全式金生物技術有限公司；質粒pMDTM19-T、FastpfuDNA聚合酶、T4 DNA酶、EcoR I、NotI和BglII 寶生物工程（大連）有限公司；參照畢赤酵母表達手冊制備酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基、最少葡萄糖（minimal dextrase agar，MD）培養基、甘油（buffered glycerol complex，BMGY）培養基、甲醇誘導（buffered methanol complex，BMMY）培養基；引物合成和核酸測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設備

CR-GIII立式高速低溫離心機 日本日立公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）核酸擴增儀 德國Biometra公司；TU-1810紫外分光光度計北京普析通用儀器有限公司；1652100電穿孔儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 甘露聚糖酶manBK基因的密碼子優化與合成

參照密碼子使用數據庫（http://www.kazusa.or.jp/codon/）中的畢赤酵母相關數據，將黑曲霉來源的manBK基因中使用頻率低于0.3的密碼子進行優化，同時使用RNA折疊網絡服務器和mRNA翻譯折疊優化的密碼子以進行蛋白質二級結構預測手動校正。GC含量設定在40%～50%之間，沒有局部峰，同時結合pPIC9K表達質粒的序列特征和插入位點，在目標基因的兩端設計并添加了酶切位點。其中，在目標基因5’端設計EcoR I（GAATTC）酶切位點序列；此外，在目標基因3’端終止密碼子（TAA）之后添加NotI（CTCGAG）酶切位點，優化后的基因由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3.2 重組菌株的構建及表達及分析

以合成的質粒pUC57-manBKopt為模板，采用引物manBKopt-PF（5’-GAATTCTCTTTCGCTTCCACTTCCGG TC-3’）（EcoR I）和manBKopt-PR（5’-GCGGCCGCTTA AGCAGAACCGATAGCAGCAACG-3’）（NotI）進行基因擴增和檢測。PCR條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。合成后的目標基因經測序驗證無誤后，采用EcoR I和NotI進行雙酶切并與pPIC9K質粒酶切片段進行連接構建重組質粒pPIC9k-manBKopt；連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布于含氨芐抗生素的LB平板上，37 ℃過夜培養。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份公司測序驗證。將pPIC9k-manBKopt質粒進行BglII酶切線性化，并電轉化至GS115感受態中，參照畢赤酵母表達手冊和酶活性篩選方法對轉化子進行篩選及誘導表達，離心收集發酵液，即為粗酶液，進行活力測定及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.3 ManBK酶活力測定

參考Miller[19]的3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法，取100 μL適當稀釋酶液和900 μL角豆膠（0.5%），在pH 5.0、50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，80 ℃反應10 min后，加入1.5 mL DNS終止反應。對照則在加入1.5 mL DNS后，補加100 μL稀釋酶液。沸水浴5 min并冷卻至室溫后在540 nm波長處測定吸光度。以每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 誘導時間和溫度對ManBK酶表達量的影響

將菌株1 mL菌液接種于100 mL的BMGY培養基中，在30 ℃條件下培養2d后離心收集菌體，轉接至100 mL的BMMY培養基中，并在30 ℃搖床培養。收集24、48、72 h和96 h時分別取樣，離心收集粗酶液，并測定酶活力，繪制菌株的產酶曲線。

將菌株1 mL菌液接種于100 mL的BMGY培養基中，在30 ℃條件下培養2 d后離心收集菌體，轉接至100 mL的BMMY培養基中，分別在22、25、28、30 ℃和32 ℃條件下200 r/min搖床培養3 d，每隔24 h添加終體積分數為1%的甲醇并取樣測定酶活力，測定菌株產酶的最適溫度。

1.3.5 反應溫度和pH值對ManBK酶活力的影響

在pH 2.0～12.0范圍條件下，測定重組酶ManBK活力，以酶活力最高值為100%計算，分析該酶的pH值反應范圍。最適pH值條件下，分別在30～90 ℃范圍內，測定重組酶ManBK活力，以酶活力最高值為100%計算，分析其反應溫度范圍。

1.3.6 金屬離子對ManBK酶活力及熱穩定性的影響

在標準反應條件下，分別測定終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的金屬離子條件下酶活力，探究金屬離子對酶活力的影響，為重組酶的貯藏、純化及應用提供一定的指導。

1.3.7 重組酶ManBK動力學參數測定

在酶最適反應條件下，以不同質量濃度的角豆膠（10、8、6、5、4、3、2、1 mg/mL）為底物測定重組酶ManBK活力，根據米氏方程雙倒數法（Lineweaver-Burk法）求得Km和Vmax。

1.3.8 魔芋聚糖降解產物含量測定及組成分析

準確稱取1 g魔芋聚糖作底物，加入到50 mL pH 5.0的50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液，攪拌30 min，隨后加入50 mL重組酶ManBK（1 100 U），70 ℃水浴90 min，100 ℃加熱滅活10 min，參照Somogyi[20]方法測定魔芋聚糖降解產物中的直接還原糖（direct reducing sugar，DRS）和總還原糖（total reducing sugar，TRS），并按下式計算平均聚合度：

平均聚合度=TRS含量/DRS含量

1.3.9 魔芋聚糖降解后的抗氧化性分析

參照Brand-Williams等[21]方法測定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，具體參照試劑盒說明書的步驟進行。

1.4 數據分析及處理

每次實驗重復測定3 次，利用Excel和SPSS 19.0軟件對測定結果進行統計分析，數據結果采用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 嗜熱甘露聚糖酶優化型manBKopt基因的設計和密碼子優化

不同物種的密碼子使用具有偏好性差異，采用畢赤酵母偏好密碼子替代目標基因中的部分密碼子開展重組酶的表達研究，基于巴斯德畢赤酵母有利密碼子合成和構建manBKopt基因。來自黑曲霉甘露聚糖酶manBK基因（XM 006962518.1）全長為1 152 bp，編碼一個含有信號肽序列（38 aa）和成熟蛋白（345 aa）的組成。去除其信號肽序列后，其成熟肽序列基因總長為1 038 bp（含終止密碼子）。重新設計的目標基因manBKopt與野生型manBK-wt序列的一致性為76%。設計后的目標基因編碼一條長度為345 個氨基酸殘基組成的重組蛋白，與manBK-wt一致。

大量研究指出，密碼子偏好性顯著影響外源基因在表達宿主中的轉錄和翻譯速率。對manBK-wt基因進行分析，結果見表1。manBKopt基因密碼子的使用頻率與畢赤酵母差異較大。CTC（Leu）、CGC（Arg）、GCG（Ala）和CCG（Pro）在畢赤酵母中的密碼子使用頻率低于30%，并且存在多個稀有密碼子聚集，如Leu87（CTC）、Arg89（CGC）和Leu90（CTC）。

CTC（Leu）密碼子使用偏好性差異最大，該基因中共出現13 次。CGC（Arg）密碼子在畢赤酵母中的使用頻率僅為10%，這些數據表明manBK-wt基因在畢赤酵母中的表達會受到一定的影響。因此，進一步對目標基因進行優化，分別將CTC（Leu）、CGC/CGT（Arg）、GCG（Ala）和CCG（Pro）替換為TTG/CTG（Leu）、AGA（Arg）、GCT/GCC（Ala）和CCT（Pro）。manBK-wt基因在優化前，其密碼子適應指數（codon adaptation index，CAI）經OptimumGeneTM軟件在線（http://www.genscript.com.cn/technology-support/on-line-tools）計算為0.61；經優化后，manBKoptCAI值達到了0.87。CAI值大于0.8表示該目標基因可以在畢赤酵母中高效表達。經分析，manBKopt基因中GC含量的變化范圍為30%～80%，過高的GC含量會影響到基因轉錄及翻譯速率，經優化后GC含量變化范圍為40%～53%，這使得GC平均值由54%調整為47%，共有242 個堿基進行了優化。

表1 野生型和優化型甘露聚糖酶manBK的密碼子使用頻率Table 1Codon usage frequencies for expression of wild-type and optimized manBK gene in P.pastoris%

續表1

2.2 重組菌manBK基因誘導表達及產物的SDS-PAGE分析

用EcoRI和NotI消化manBKopt基因并克隆至pPIC9K中構建表達質粒。經雙酶切檢測及DNA測序結果分析，正確構建pPIC9k-manBKopt。經BglII限制酶線性化后，電擊轉入到GS115感受態細胞并在MD平板上培養，參照畢赤酵母表達手冊方法，挑取48 個轉化子進行陽性篩選，以角豆膠為底物，測定甘露聚糖酶的活性，共獲得陽性轉化子37 個。選取酶活力最高的30號轉化子進行搖瓶水平誘導表達研究。將重組菌株在30 ℃條件下搖床培養并進行誘導表達，對細胞發酵液進行酶活力檢測，為11.4 U/mL。

圖1 ManBK酶的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the ManBK enzyme

經SDS-PAGE分析得出重組酶ManBK表觀分子質量為45 kDa，比理論分子質量37.7 kDa偏大，經糖基化預測軟件NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分析發現該蛋白ManBK氨基酸中存在2 個潛在的N-糖基化位點（Asn-Xaa-Ser/Thr）分別是N156和N225位點。經脫糖基酶Endo H消化后，形成1 條約為38 kDa的蛋白條帶（圖1），結果表明ManBK酶在表達的過程中進行了N-糖基化加工修飾。

2.3 工程菌生產ManBK酶條件及酶學特性分析

圖2 ManBK酶的產酶條件和酶學性質Fig.2 Production conditions and enzymatic properties of ManBK

由于不同蛋白一級結構、蛋白穩定性及宿主蛋白酶的差異，使得誘導溫度對工程菌的產酶情況有較大影響。經測定，菌株在不同的誘導溫度下產酶量差異明顯，該菌株在25 ℃誘導條件下產酶量最高（圖2A）。誘導溫度過高或過低都不利于酶的正確折疊和后修飾，在22 ℃和32 ℃誘導條件下僅能維持70%的產酶量。如圖2B所示，以1%（V/V）接種量接菌至BMGY培養基中進行甲醇誘導產酶，隨著誘導時間的延長，菌株的產酶量也隨之增加，當誘導培養72 h后，產酶量達到最大值，其酶活力為22 U/mL，隨后的24 h產酶量略有減少，這很可能是由于酶受到內源蛋白酶或其他因素造成的降解。

ManBK酶在pH 5.0、30～90 ℃條件下的酶活力如圖2C所示。該酶最適反應溫度為80 ℃，即使在90 ℃的高溫下仍存在40%的酶活力，屬于嗜熱酶。該酶的反應溫度范圍較廣，在30～90 ℃之間具有40%以上的酶活力，能夠滿足不同的反應溫度需求。重組酶ManBK的最適pH值為5.0，屬于酸性甘露聚糖酶，該酶在pH 4.0～6.0范圍內酶促反應時能夠維持其70%以上的酶活力（圖2D）。

2.4 金屬離子和化學試劑對重組酶活力的影響及動力學參數

金屬離子種類和濃度對酶活力的影響差異較大，如表2所示，在低離子濃度條件下（1 mmol/L），K＋、Li＋、Mn2＋和Cu2＋對ManBK酶有不同程度的抑制作用，其中Li＋的抑制最為強烈（抑制率100%），其他抑制率為20%左右，而金屬離子Fe3＋、Mg2＋、Ca2＋和Zn2＋則極顯著促進了重組酶ManBK活性，分別使酶活力提高了32%、23%、52%和459%。進一步對高離子濃度（5 mmol/L）下酶活性的研究結果表明，Mg2＋和Ca2＋依然對酶活力有較強烈的促進，分別使酶活力提高了234%和263%，而Zn2＋則未表現出酶活力的促進作用。

酶的熱穩定性直接影響酶使用效果和應用范圍，通過測定Mg2＋、Ca2＋和Zn2＋作用下，ManBK酶在70、85 ℃和95 ℃條件下的半衰期，探究這3 種離子對酶熱穩定性的影響，結果如表2所示。經分析發現，Zn2＋能延長酶的半衰期，使得ManBK酶在70、85 ℃和95 ℃條件下的半衰期分別延長了116、3.2 min和1.5 min。Mg2＋和Ca2＋并沒有起到增強酶熱穩定性效果。

表2 金屬離子對ManBK相對酶活力及熱穩定性的影響Table 2 Effect of metal ions and chemical reagents on the activity and thermal stability of ManBK

按照雙倒數法繪制以角豆膠為底物的ManBK酶的動力學曲線，計算得出ManBK酶的Km值為1.40 mg/mL，Vmax值為149.25 μmol/（min·mg）。

2.5 ManBK酶在魔芋聚糖降解中應用

為更好探究ManBK酶在魔芋聚糖降解中的應用特性，進行魔芋聚糖酶解過程中平均聚合度及降解產物抗氧化特性測定，結果如圖3所示。

圖3 魔芋聚糖降解產物平均聚合度和抗氧化活性的變化規律Fig.3 Change in polymerization degree and antioxidant activity of konjac glycan degradation products

隨著酶作用時間的延長，魔芋聚糖降解產物的平均聚合度逐漸降低，表明ManBK酶將魔芋聚糖進行了有效降解，釋放出大量的還原糖。當反應進行到1.5 h后，糖含量基本增加不明顯，平均聚合度基本保持不變（圖3），因此當酶底比為1∶1時，反應溫度70 ℃，pH 5.0反應進行1.5 h，即可達到較合適的酶解時間。

魔芋聚糖經ManBK酶降解后的產物進行冷凍干燥處理，與VC、甘露寡糖（商品）和魔芋聚糖同時測定不同質量濃度下的DPPH自由基清除率，上述物質都表現出不同程度的抗氧化性，且基本上隨著質量濃度的增加抗氧化性能逐漸增強，而重組酶ManBK并未表現出抗氧化性能。魔芋聚糖雖然也表現一定的抗氧化性能，但是經ManBK酶降解后制備的魔芋聚糖降解產物的抗氧化性能大幅度增強，兩者抗氧化性能最高相差5.6 倍左右。商品化寡糖與ManBK酶制備的魔芋聚糖降解物的抗氧化性能比較發現，后者的抗氧化性能是前者的2～4 倍。綜上，ManBK酶在魔芋聚糖深加工中具有極強的應用潛力。

3 討 論

較高的催化反應速率、較低的雜菌污染、簡化的生產工藝等優點，使得嗜熱酶在在工業領域應用潛力巨大[22]。甘露聚糖酶依據氨基酸序列和結構的一致性差異可被分為GH5、GH26、GH113和GH134家族，其中GH5和GH134主要分布在真菌微生物中，而GH26和GH113家族主要來自細菌[23]。目前，嗜熱甘露聚糖酶主要來自GH5家族，ManBK01就是其中之一，是唯一完成解析晶體結構的嗜熱甘露聚糖酶。據報道，嗜熱酶基因可以在中溫的大腸桿菌和酵母菌表達宿主中按照正確構象進行折疊表達，這使得嗜熱酶可以從中溫表達宿主中獲得，極大方便對嗜熱酶的研究。嗜熱甘露聚糖酶manBK在畢赤酵母中異源表達，經性質測定分析發現異源表達酶蛋白與野生型酶蛋白酶學性質一致。如何進一步提高嗜熱酶ManBK的表達量、提高酶的熱穩定性、探究酶在食品加工中的應用潛力成為該酶研究的新階段內容。

manBKopt基因密碼子的使用頻率與畢赤酵母差異較大，其中CTC（Leu）密碼子使用偏好性差異最大，CGC（Arg）密碼子在畢赤酵母中的使用頻率僅為10%。本研究獲得的轉化子酶活力為11 U/mL，遠低于Do等[11]的報道（660 U/mL）。分析其原因可能是兩者的表達系統的差異所致，本研究采用pPIC9K和畢赤酵母GS115表達系統，而Do等[11]采用pPICZαA和畢赤酵母X33表達系統；另外一個可能原因是manBK基因在兩者宿主中的拷貝數的差異，在一定程度上基因拷貝數與基因表達量呈正相關，兩者最終子宿主的拷貝數差異還需進一步研究。經SDS-PAGE分析發現，本研究所表達蛋白純度較高，電泳純能達到99%，能夠大幅度簡化對酶下游的提取工藝。

研究發現重組酶ManBK的表觀分子質量遠大于其理論分子質量，經分析酶蛋白分子的N-糖基化是造成分子質量增大的主要原因。產物的糖基化修飾作為真核表達系統重要的加工修飾方式，影響產物的分子質量、穩定性和催化效率等諸多屬性，真核生物的糖基化對于維持蛋白的功能及穩定性方面有重大的作用[24-25]，而對其他性質（如催化效率和熱穩定性）的影響并不清楚，還需進一步分析。 重組酶ManBK最適pH值為5.0，這與大多數GH5家族甘露聚糖酶的性質相類似（最適pH 1.5～7.0）[26]。ManBK酶最適反應溫度為80 ℃，并且該酶即使在90 ℃時依然能夠維持40%的酶活力，屬于典型嗜熱酶，這與Do等[11]研究結果一致。

Zn2＋、Ca2＋和Cu2＋對該酶活力性有較大促進，Do等[11]也得出了一致的結論，但是上述金屬離子對甘露聚糖酶的影響效應并不適用于所有甘露聚糖酶，如Yin等[27]報道Zn2＋和Cu2＋對甘露聚糖酶具有強烈抑制作用，使活性降低了60%和80%。Regmi等[28]研究發現，Ca2＋抑制了20%左右的酶活力。對于提升酶的熱穩定性普遍采用酶的定向改造、包被處理，而采用金屬離子輔助提升酶穩定性的相關研究較少[29-30]。本研究除探究金屬離子對酶活力性的影響之外，經Zn2＋、Ca2＋和Cu2＋對酶熱穩定性分析發現，1 mmol/L濃度下，Zn2＋對酶的熱穩定性表現出了較好的促進作用，使得重組酶ManBK在70 ℃的半衰期增長116 min。本研究對采用嗜熱甘露聚糖酶制備甘露寡糖進行了聚合度及抗氧化性分析，嗜熱酶能夠將魔芋聚糖高效降解成低聚糖，且產物表現出較好的抗氧化性能。