代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產甲硫氨酸

趙 蘭，劉詩夢，秦漢雄，王亞南，樊占青，閔偉紅

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

甲硫氨酸是生命體不可缺少的唯一含硫必需氨基酸，作為多種重要代謝物質的合成前體，參與機體細胞內轉甲基和轉硫基過程，對生物體新陳代謝起重要作用[1]。由于動物體內無法自身合成，必須從外部食物中獲取，因此被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等多個領域，需求量巨大且附加值較高[2]。目前，甲硫氨酸的生產方法主要為化學合成法，該方法存在污染大、耗能高且產物不易分離等諸多不利因素[3]，國內外研究學者及生產者不斷尋求環境友好的微生物發酵法替代此方法生產。

但目前微生物發酵法難以實現工業化生產，其主要原因為微生物體內合成的代謝系統較為復雜，受到嚴格的調控作用，使得碳流競爭激烈無法為甲硫氨酸提供足夠碳骨架[4-5]。甲硫氨酸合成途徑中的關鍵酶，受到副產物賴氨酸及蘇氨酸嚴格反饋抑制及反饋阻遏，影響了甲硫氨酸的合成[6]。需要改造具有解除末端氨基酸抑制作用的高酶活性突變菌，促使更多的碳流量進入甲硫氨酸合成途徑。研究學者已相繼解析了合成途徑關鍵酶天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）及高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HSD）的晶體結構、抑制方式、調節機制和效應物結合位點，為改造氨基酸生產菌株提供新的參考[7-11]。其次蘇氨酸及賴氨酸支路對碳流量競爭激烈，影響了甲硫氨酸的合成。合成過程中，因碳流存在優先合成天冬氨酸半醛的調控機制使得蘇氨酸與甲硫氨酸競爭更為激烈[12]，又因單一敲除蘇氨酸支路會導致菌株代謝不平衡，難以正常生長[13]，因此可考慮采用系統代謝工程[14]獲得弱化蘇氨酸支路的生產菌株。使所合成蘇基酸量僅供應菌株生長，同時解除其對AK及HSD的抑制作用，最終提高產量。本實驗室以抗結構類似物北京棒桿菌（Corynebacterium pekinense）E31為基礎，對天冬氨酸族氨基酸代謝途徑的關鍵酶進行研究，發現了單體酶AK，篩選出影響AK及HSD活性的多個關鍵殘基位點，構建了多株高酶活性且解除反饋抑制作用的菌株[15-17]。

谷氨酸棒桿菌具有代謝調控系統簡單、遺傳背景清晰且無致病性等優點，常被用來生產天冬氨酸家族氨基酸[18-21]。本研究對谷氨酸棒桿菌代謝途徑進行改造，通過不同遺傳操作手段逐步探究合成途徑阻遏關鍵位點。在對合成途徑關鍵酶AK、HSD及高絲氨酸乙?；D移酶（homoserine acetyltransferase，HAT）[22]進行改造的基礎上構建串聯過表達載體，以增強各關鍵酶的表達量，最終通過實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）、高效液相色譜分析基因表達情況及氨基酸變化情況，探究碳流阻遏點。并對蘇氨酸支路thrB的底物高絲氨酸結合位點A20進行酸性、堿性、極性和非極性4 種類型8 種不同氨基酸定點突變研究，篩選相比于原菌酶活性降低的突變體。以期為規模化微生物發酵法生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

谷氨酸棒桿菌ATCC13032、北京棒桿菌AS1.299、天冬氨酸重組載體（PET28a-lysC）及HSD重組質粒（PMD18T-hom）、克隆宿主大腸桿菌DH5α和表達宿主大腸桿菌BL21（DE3）均由實驗室提供；穿梭表達載體PECXK99E 湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與培養基

MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、ExTaq?Prime STAR?HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、pMD?18-T Vector Cloning Kit、DpnI消化酶 TaRaKa（大連）有限公司；ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 諾唯贊生物科技有限公司；BamHI、EcoRI、HindIII、salI、sacI等限制性核酸內切酶 莫納（蘇州）生物科技有限公司；DiaSpin Plasmid Mini-Preps Kit、DiaSpin DNA Gel Extraction Kit生工生物工程（上海）股份有限公司；real-time PCR相關試劑盒TransGen Biotech試劑公司；丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐霉素、卡那霉素 北京鼎國生物公司；SB C18柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm） 安捷倫科技（中國）有限公司。

LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L（固體培養基另外添加20 g/L瓊脂糖）。種子培養基：葡萄糖25 g/L，玉米漿20 g/L，尿素1.25 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO45 g/L，pH 7.2。發酵培養基：葡萄糖30 g/L、玉米漿10 g/L、生物素0.05 mg/L、KH2PO40.5 g/L、VB10.5 mg/L、VB63.0 mg/L、VB120.1 g/L、(NH4)2SO410 g/L、MnSO45 mg/L、FeSO45 mg/L、MgSO40.25 g/L及CaCO310 g/L，pH 7.2。谷氨酸棒桿菌感受態制備培養基：酵母浸粉2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，甘氨酸3 g/L，吐溫80 0.1%。谷氨酸棒桿菌電轉化恢復培養基：酵母浸提物2.5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，D-山梨醇91 g/L，腦心浸液18.5 g/L。固體培養基加入瓊脂粉20 g/L。必要時添加質量濃度為30 μg/mL的卡那霉素。

1.2 儀器與設備

DYCP-31DN核酸電泳儀 北京市六一儀器廠；Research plus移液槍 德國Eppendorf公司；WFH-201BJ瓊脂糖凝膠像成像儀 美國GE公司；TissuePrep快速組織細胞破碎儀 杰靈科技有限公司；Mx3000P熒光定量PCR儀、XDB-C18液相色譜柱 安捷倫科技有限公司；DL-CJ-2N熒光定量PCR工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；ACQUITY高效液相色譜 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載體與引物

表1 本研究構建質粒Table 1 Plasmids and strains used in this study

本實驗構建載體如表1所示。NCBI數據庫谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組序列為基礎，利用Primer 5.0軟件進行目的基因克隆引物設計，通過南京諾唯贊生物科技有限公司CE Design V1.04及Primer 5.0軟件進行同源臂擴增引物設計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體引物設計如表2所示。

表2 PCR擴增引物Table 2 Sequences of primers used for PCR

續表2

1.3.2 關鍵酶過表達載體構建與發酵分析

(二)文藝影視及文學作品中的經典臺詞。影視作品的熱播、文學作品出爐以及許多文藝節目的火爆，往往使其中的經典臺詞備受關注，成為流行語。如：

1.3.2.1 過表達載體構建

同源臂引物擴增實驗室篩選并保存的北京棒桿菌高酶活性目的基因AKM372I/T379W（簡稱lysCm）及帶有SD序列的目的基因homL206D（簡稱homm），從谷氨酸棒桿菌基因組上擴增HAT編碼基因metX，并連接于PMD-18T重組載體上，重組載體上擴增帶有SD序列的目的片段SD-metX。PCR條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存10 min。通過ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit連接試劑盒構建重組載體PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX，按照說明書添加相應試劑，混合后37 ℃反應30 min，立即置于冰上冷卻，將待轉入100 μL的DH5α感受態細胞置于冰上解凍，取10 μL重組產物反應液加入感受態細胞中，緩慢吹打混勻，冰上預冷30 min，42 ℃熱激90 s后立即冰上孵育10 min，添加600 mL LB培養基中，水平搖床37 ℃、200 r/min振蕩培養30 min后離心去上清液，剩余菌液涂布于含30 μg/mL卡那霉素抗生素平板上進行修復培養，挑取單菌落送于生工生物工程（上海）股份有限公司測序。并將測序成功的重組載體電轉入谷氨酸棒桿菌。

1.3.2.2 real-time PCR分析

首先進行引物濃度優化，選擇200 nmol/L為引物終濃度。選取經IPTG誘導后的菌體進行real-time PCR檢測。利用液氮組織研磨機對菌株進行破碎處理，根據TransZol Up Plus RNA Kit細菌RNA提取試劑盒提取總RNA。測定RNA提取質量，選取R值在1.8～2.0之間質量較好的樣品進行逆轉錄實驗，獲取cDNA模板進行realtime PCR驗證。PCR條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃終延伸5 min。其中步驟2～4重復40 個循環，采集退火時間段內熒光信號。參照-2-ΔΔCt模型處理數據。

1.3.3 過表達菌株發酵高效液相色譜分析

對構建的過表達菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX和野生WTg1進行72 h發酵培養，每6 h留取樣品，測定還原糖含量及生長曲線[23-25]。對谷氨酸棒桿菌天冬氨酸家族幾種重要的氨基酸變化情況進行分析，尋找代謝途徑阻遏原因。

配制天冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸標準品，每種氨基酸濃度為10 nmol/μL，根據安捷倫提供advance Bio AAA試劑和標準品說明書配制17 種氨基酸混合標準品。以鄰苯二甲醛及9-氯甲酸芴甲酯進行發酵液柱前衍生，17 種氨基酸混合標準品進行液相色譜條件摸索，直到在38 min內各峰均分離良好。流動相A、B見表3，A、B相均用0.45 μm再生纖維素膜過濾，超聲處理充分混合。柱溫40 ℃，流速1.2 mL/min，檢測波長338 nm（高絲氨酸265 nm），進樣量9 μL。具體的梯度洗脫程序如表3所示。

表3 梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution program

1.3.4 蘇氨酸支路thrB突變體酶活性分析

1.3.4.1 HSK體外載體構建

采用常規CaCl2法制備BL21宿主感受態，提取谷氨酸棒桿菌基因組，同源臂引物擴增thrB目的基因并與帶有組蛋白（His）的原核表達質粒PET-28a連接，構建重組表達載體PET-thrB。

根據谷氨酸棒桿菌ATCC13032的thrB基因序列及其與大腸桿菌共同偏好密碼子設計引物，對thrB重組載體的底物高絲氨酸結合位點A20定點突變[26]，經DpnI消化后熱激法轉入BL21感受態，活化培養后送于生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4.2 酶促動力學分析

將測序成功菌株按2%接種量轉接到100 mL LB搖瓶內進行擴大培養。當菌體濃度（OD600nm）達到0.6時，添加終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導蛋白表達，25 ℃、130 r/min過夜培養，4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，加入10 mL預冷磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體，超聲破碎離心后取上清液進行0.22 μm濾膜處理即為AK粗酶液，通過非變性鎳柱不同濃度咪唑溶液梯度洗脫去除雜蛋白，最后經500 mmol/L咪唑洗脫得到的溶液即為thrB突變體純化液[27]。對野生型和突變體分別進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[28]分析。

HSK活性測定參照Lee等[29]方法略有改動，每組3 個平行實驗。測定0.5～15 mmol/L不同底物濃度條件下thrB突變體純化酶活性，以米氏方程進行非線性擬合，得到酶動力學曲線。300 μL反應終濃度體系：0.5 mmol/L NADH，10 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L磷酸烯醇丙酮酸，7 mmol/L KCl，3 mmol/L ATP，10 U丙酮酸激酶，15 U乳酸脫氫酶，50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4），3 mol/L高絲氨酸。25 ℃溫育10 min連續監測法實時監測OD340nm的降低，進而確定HSK催化L-高絲氨酸的反應速度，每分鐘催化1 μmol高絲氨酸轉化O-磷酸高絲氨酸所需酶量為1 個酶活性單位，計算Vmax及Km值。其中Vmax表示在一定酶量下的最大反應速率，即酶完全被底物飽和時的反應速度，與酶濃度呈正比。Km值表示酶促反應的初速率為Vmax一半時的底物濃度，單位為mmol/L。

1.3.4.3 酶學性質表征

最適溫度：野生型純化后WT-thrB酶活性最適溫度為25 ℃，反應體系不變的情況下，在不同溫度（18、20、24、28、32、36、 40、44、48 ℃）下連續監測反應30 min，每組樣品3 次平行，最高酶活性定義為100%。

最適pH值：野生型純化后WT-thrB酶活性最適pH 8.0，反應體系不變的情況下，調節反應體系中Tris-HCl緩沖液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0），連續監測反應30 min，每組樣品3 次平行，最高酶活性定義為100%。

穩定性：在最適溫度和最適pH值下，將thrB突變體純化酶加入反應體系中，反應連續4.5 h內測定酶活性，初始酶活性定義為100%，并以時間為橫坐標，相對酶活性為縱坐標，每隔30 min檢測酶活性，每組樣品3 次平行。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 過表達連接及real-time PCR分析

本研究組已對北京棒桿菌AS1.299基因組AK及HSD進行克隆、突變和篩選研究，并對所得突變體進行酶動力學分析，其中AK M372、T379位點是抑制劑賴氨酸結合口袋的關鍵殘基且高度保守，突變體AKM372I/T379W有效削弱了賴氨酸與結合口袋附近殘基的結合，解除了賴氨酸對AK的反饋抑制作用，突變后最適pH值減小，耐受范圍變廣，半衰期有所延長，相比WT AK活性提高36.37 倍。HSD第206位點在家族中高度保守，參與底物的結合，突變成異亮氨酸后側鏈官能團減小，空間位阻降低，更有利于與底物結合，HSDL200D相比于WT HSD活性提高了17.68 倍[30]?；驍U增及載體構建結果如圖1所示。圖1A中，擴增AK目的基因lysCm為1 274 bp，擴增HSD目的基因homm為1 338 bp，擴增HAT目的基因metX為1 140 bp。擴增所得長度與目的片段大小相符，證明各連接目的片段擴增成功。圖1B中，穿梭表達載體PECXK99E大小為7 018 bp，重組載體擴增得到4 000 bp左右lysCm-SD-homm-SD-metX連接片段，證明過表達載體構建成功。

圖1 過表達基因擴增（A）及載體構建核酸電泳驗證（B）Fig.1 Amplification of the overexpressed genes (A) and nucleic acid electrophoresis verification of the constructed vector (B)

以谷氨酸棒桿菌的DnaE基因作為內參基因，對野生型谷氨酸棒桿菌WTg1及過表達菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX中lysC、hom和metX基因進行real-time PCR分析。結果顯示，WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX中lysC、hom和metX的表達量分別為出發菌株WTg1中對應基因表達量的6.896、2.378 倍和1.659 倍，表明AK、HSD及HAT基因串聯過量表達有效。

2.2 過表達菌株高效液相色譜分析

分別對野生型菌株WTg1和過表達菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX進行微生物發酵培養，并對72 h發酵上清液進行反相高效液相色譜檢測[31-34]，結果如表4所示。過表達菌株天冬氨酸、谷氨酸積累量降低顯著，無明顯積累；蘇氨酸和異亮氨酸產量同步降低；賴氨酸產量相應提高，甲硫氨酸產量明顯提高。

表4 發酵液氨基酸質量濃度Table 4 Concentrations of amino acids in fermentation broths g/L

過表達AK使得碳源流經三羧酸循環后更易流經天冬氨酸下游支路氨基酸的合成，使得Glu產量由原菌的1.45 g/L減少到0.07 g/L。real-time PCR分析可見過表達后HSD轉錄水平提高到2.378 倍，使得天冬氨酸積累量降低至0.09 g/L，碳流量途經中間酶AK及HSD不會產生過多積累，更有利于下游氨基酸的合成。過表達HAT使蘇氨酸由原菌2.93 g/L降至1.61 g/L，賴氨酸產量變化不大，甲硫氨酸產量相比原菌提高到2.26 倍，達到4.14 g/L。

結合real-time PCR及液相色譜氨基酸分析，改造并過表達甲硫氨酸支路關鍵酶可有效促進碳流量，減少谷氨酸棒桿菌代謝途徑中主要谷氨酸積累，提高了甲硫氨酸產量。同時發現，經改造后菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX代謝途徑中蘇氨酸積累量過多，是甲硫氨酸合成途徑碳流競爭的第一大氨基酸。推測如果有效減少蘇氨酸產量將更有利于提高甲硫氨酸產量，故本實驗試圖對蘇氨酸支路首個關鍵酶thrB進行弱化研究。

2.3 thrB突變載體構建

本實驗從谷氨酸棒桿菌基因組上擴增HSK目的基因thrB進行PET-28a表達載體連接。進行1%瓊脂糖核酸電泳驗證，圖2A中，基因組擴增thrB靶片段為1 000 bp，重組載體PET-thrB為6 369 bp，連接載體雙酶切驗證，兩條明顯條帶分別于1 000 bp及5 000 bp左右，這與目的片段及線性化載體大小相符。圖2B為重組載體突變后PCR擴增電泳，證明質粒在引物作用下實現了大量的復制。目的片段送于生工生物工程（上海）股份有限公司測序，連接成功。

圖2 載體構建（A）及突變PCR產物（B）瓊脂糖核酸電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of the constructed vector (A) and site-directed mutations (B)

2.4 thrB突變株酶活性篩選及分析

野生型和突變體經非變性鎳柱純化后進行12% SDSPAGE驗證實驗（圖3）。野生型和突變體純化酶在12%SDS-PAGE的37 kDa左右處均存在單一明亮條帶，表明thrB突變體蛋白在誘導劑IPTG的作用下表達成功，可用于酶動力學測定及酶學性質表征。

圖3 12%SDS-PAGE分析Fig.3 12% SDS-PAGE analysis of the overexpressed protein

本實驗對thrB進行酸、堿、極性和非極性4 種性質8 種氨基酸進行定點突變，并對突變體進行酶動力學研究及酶學性質表征，結果如表5所示。HSK 20位點丙氨酸突變成8 種不同氨基酸后酶活性多數降低，由各菌株Vmax可以看出其中突變體thrB-A20H及thrB-A20Y的酶活性降低較為顯著，分別為WT-thrB的43%及39%，最適溫度升高至30 ℃和35 ℃。堿性氨基酸組氨酸最適pH值增加至8.5，半衰期延長，更有利于微生物發酵生產蛋氨基酸。

表5 各菌株HSK活性Table 5 HSK activity of each strain

突變體thrB-A20Y酶活性降至原菌39%，酶活性降低最為顯著，對該突變位點進行原子間靜電力及Pymol圖譜分析，見圖4。靜電勢由±74.552 kJ/mol變為±74.573 kJ/mol，這可能是由于非極性氨基酸丙氨酸突變為極性氨基酸酪氨酸，導致氫鍵供體數增加，極性表面積增大。酪氨酸側鏈較大，與底物高絲氨酸的空間位阻增大距離變遠，導致高絲氨酸不能很好地進入底物結合口袋，影響酶與底物結合效率，使酶活性降低。

圖4 thrB-A20Y突變后氨基酸靜電勢及與底物之間Pymol圖Fig.4 Electrostatic potential of amino acids and Pymol diagram between amino acids and substrate after thrB-A20Y mutation

3 結 論

本實驗通過在谷氨酸棒桿菌內串聯表達合成途徑關鍵酶基因LysCm、homm和metX，獲得菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX，有效增加了合成途徑的碳流量，使積累量大幅度提高，達到4.14 g/L，實現了產量的提高。實驗對蘇氨酸支路關鍵酶thrB基因進行定點突變研究，獲得多株酶活性降低突變株，其中thrB-A20Y活性降至原菌39%，為微生物體內弱化蘇氨酸支路、增強甲硫氨酸積累提供理論基礎。