葛氏鱸塘鱧魚頭多糖的制備、結構鑒定及體外生物活性分析

高陽楊，閆曉慧，朱 暢，張佳霖，劉學軍,

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林工商學院財稅學院，吉林 長春 130507；3.吉林工程職業學院食品工程分院，吉林 四平 136000；4.吉林省輕工業設計研究院，吉林 長春 130021）

葛氏鱸塘鱧（Perccottus glenii），塘鱧科，鱸塘鱧屬，俗名老頭魚、沙姑鱸子，是我國北方地區一種小型底棲肉食性土著魚類，主要分布于黑龍江、圖門以及遼河水系。與一般淡水魚相比，葛氏鱸塘鱧生命力強、極耐缺氧、肉質細嫩、無肌間刺，是最受消費者青睞的淡水魚類品種之一[1]。但其頭部大，肉質少，經常被丟棄。

糖類的研究重點已經從單純的結構研究轉向構效關系。研究表明多糖具有抗氧化[2]、抗疲勞[3]、抑制腫瘤[4]、抑菌[5]、提高人體免疫力[6]、降血壓[7]、降血糖[8]等生物活性。在動物多糖方面，僅集中于部分水產品，如鮑魚內臟[9]、牡蠣肉[10]、池沼公魚多糖[11-12]等方面的研究，而對于葛氏鱸塘鱧魚頭多糖（polysaccharide fromPerccottus gleniihead，PGP）的研究鮮見報道。

目前，已有研究表明淡水魚魚頭中含有較高含量的多糖[13]。因此，本實驗研究PGP的制備工藝、結構表征及生物活性，為副產物資源的綜合利用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的葛氏鱸塘鱧購于長春市同鑫水產批發市場，取魚頭洗凈分裝于真空包裝袋中，-20 ℃保存。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、阿卡波糖、血管緊張素I轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、α-葡萄糖苷酶、對硝基苯-α-D-半乳糖吡喃葡萄糖苷（p-nitrobenzene-α-D-galactose glucopyranoside，PNPG）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（horseuria-histamine-leucine，HHL） 美國Sigma公司；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 上海源葉生物有限公司；有機溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

H-2050R離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；FD-80型真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；IR RESTIGE-21傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；XL-30 ESEM FEG掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；6890-5975型氣相色譜-質譜聯用儀美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取

取葛氏鱸塘鱧魚頭（100 g）洗凈瀝干，破碎機破碎；按料液比1∶3（g/mL）加入石油醚浸泡（30 ℃、 2 h）；按料液比1∶2（g/mL）加入生理鹽水勻漿10 min；4 ℃離心（3 800×g、15 min）后，獲得沉淀物和上清液1；沉淀物中加入5 倍體積0.1 mol/L的NaOH溶液進行堿解（30 ℃、8 h），隨后4 ℃離心（3 800×g、15 min），獲得上清液2；合并上清液1和上清液2，旋轉蒸發，抽濾去雜，獲得濃縮液；濃縮液中加入4 倍體積的95%乙醇溶液（4 ℃、12 h）；醇沉后離心（3 800×g、15 min），將沉淀冷凍干燥，獲得PGP。

1.3.2 多糖得率與含量測定

1.3.2.1 多糖得率的測定

按式（1）計算多糖得率[14]：

1.3.2.2 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[15]。在波長490 nm處測定吸光度，以葡萄糖為對照品繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.011 08X＋0.000 4，R2=0.999 6。式中：X為質量濃度（mg/mL），Y為吸光度。根據回歸方程計算樣品總糖的質量濃度，按式（2）計算總糖質量分數：

1.3.2.3 蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍法[16]。在波長595 nm處測定吸光度，以BSA為標準品繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.006 6X＋0.009 6，R2=0.999。式中：X為質量濃度（mg/mL）；Y為吸光度。根據回歸方程計算樣品蛋白質的質量濃度，按式（3）計算蛋白質量分數：

1.3.2.4 脂肪含量及脫除率的測定

分別制備葛氏鱸塘鱧魚頭未脫脂和經石油醚脫脂的粗多糖，對2 種多糖采用索氏抽提法[16]按式（4）、（5）計算脂肪質量分數和脫除率：

1.3.3 PGP脫蛋白工藝篩選

采用Sevag法、胃蛋白酶法、胃蛋白酶法與Sevag法聯用、木瓜蛋白酶法以及木瓜蛋白酶法與Sevag法聯用脫除蛋白質。按式（6）～（8）計算蛋白脫除率、多糖損失率及羥自由基半清除率，以衡量脫蛋白效果。

式中：A0為蒸餾水代替樣品的吸光度；Ax為樣品組的吸光度；Ax0為蒸餾水代替H2O2的吸光度。

1.3.3.1 Sevag法

參照伍善廣等[17]的方法，采用Sevag試劑（氯仿-正丁醇（4∶1，V/V））對PGP樣品進行脫蛋白處理，重復操作6 次，每次均取出一定量的上層水溶液測定并按式（6）～（8）計算蛋白脫除率、多糖損失率及羥自由基半清除率。

1.3.3.2 胃蛋白酶法

參照李冬梅[18]的方法，加入2%胃蛋白酶對PGP樣品進行酶解脫蛋白處理，離心取上清液測定并按式（6）～（8）計算蛋白脫除率、多糖損失率及羥自由基半清除率。

1.3.3.3 胃蛋白酶與Sevag法聯用

根據1.3.3.2節獲得胃蛋白酶脫蛋白多糖溶液，再根據1.3.3.1節Sevag法進行一次脫蛋白處理，測定并按式（6）～（8）計算蛋白脫除率、多糖損失率及羥自由基半清除率。

1.3.3.4 木瓜蛋白酶法

參照于曉紅等[19]的方法，加入2%木瓜蛋白酶對PGP樣品進行酶解處理。離心取上清液測定并按式（6）～（8）計算蛋白脫除率、多糖損失率及羥自由基半清除率。

1.3.3.5 木瓜蛋白酶與Sevag法聯用

根據1.3.3.4節獲得木瓜蛋白酶脫蛋白多糖溶液，再根據1.3.3.1節的Sevag法進行一次脫蛋白處理。測定并按式（6）～（8）計算蛋白脫除率、多糖損失率及羥自由基半清除率。

將5 種脫蛋白方法建組對比，分析最優脫蛋白工藝。將PGP脫蛋白溶液進行醇沉、離心、透析、冷凍干燥，獲得脫蛋白多糖（deproteinized polysaccharides fromPerccottus gleniihead，PGP-D）。

1.3.4 單糖組成測定

1.3.4.1 多糖的水解

精確稱取10 mg PGP-D于反應釜中，加入2 mL的4 mol/L三氟乙酸溶液，置于烘箱內110 ℃水解3 h，冷卻至室溫，放入真空干燥箱70 ℃減壓干燥。

1.3.4.2 多糖的衍生

向經水解干燥的PGP-D中加入1 mL吡啶后，立即加入1 mL硅烷化試劑，防止空氣中的水分進入。振蕩充分溶解后，于50 ℃恒溫干燥箱中反應40 min，冷卻至室溫，取上清液進行氣相色譜-質譜聯用測定其單糖組成。

1.3.4.3 氣相色譜-質譜檢測條件

氣相色譜條件：DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；載氣為氦氣；柱壓73.0 kPa；柱流量1 mL/min；分流比10∶1；程序升溫：80 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，進樣量1 μL。

質譜條件：離子源溫度200 ℃，質量掃描范圍m/z20～800。

1.3.5 紫外光譜測定

用蒸餾水配制質量濃度為0.050 mg/mL的PGP-D溶液，注入石英比色皿中，使用紫外-可見分光光度計，以蒸餾水校準基線，在190～400 nm內進行全波長掃描[20]。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測定

將PGP-D與KBr按質量比1∶100充分研磨混勻后壓片。以KBr為空白，置于傅里葉變換紅外光譜儀，在4 000～400 cm-1區間內進行紅外光譜掃描[21]。

1.3.7 掃描電鏡觀察

樣品進行鍍金后，采用掃描電子顯微鏡觀察PGP和PGP-D表面的微觀形態[22]。

1.3.8 體外生物活性測定

1.3.8.1 羥自由基清除能力測定

參照Fan Jing等[23]的方法，以VC為陽性對照，采用Fenton反應體系測定不同質量濃度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）多糖樣品溶液對羥自由基的清除能力，按式（8）計算。

1.3.8.2 總還原能力測定

參照Hu Haobin等[24]的方法，以VC為陽性對照，測定不同質量濃度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的多糖樣品溶液的總還原能力。在波長700 nm處測定溶液的吸光度，吸光度越大代表還原能力越強。

1.3.8.3α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參照Zhang Ziling[25]、徐靜珠[26]等的方法，采用PNPG比色法測定不同質量濃度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的多糖樣品溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。在波長400 nm處測定酶作用下釋放出硝基酚含量的吸光度。樣品對α-葡萄糖苷酶抑制率按式（9）計算。

式中：Aa為對照組的吸光度；Ab為對照空白組的吸光度；Ac為樣品組的吸光度；Ad為樣品空白組的吸光度。

1.3.8.4 ACE抑制活性測定

參照Tan[27]、張夢娟[28]等的方法，測定不同質量濃度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）多糖樣品溶液對ACE的抑制能力。在波長228 nm處測定吸光度，ACE抑制率按式（10）計算：

式中：Aa為ACE和ACE抑制劑同時存在的吸光度；Ab為不加抑制劑的吸光度；Ac為ACE和HHL空白反應的吸光度。

1.4 數據分析與處理

2 結果與分析

2.1 PGP理化性質

PGP得率為8.2%，總糖質量分數為11.5%，蛋白質量分數為69.9%，未脫脂脂肪質量分數為0.6%，脫脂脂肪質量分數為0.1%，脫脂率為83.3%。

2.2 PGP脫蛋白工藝篩選

圖1 Sevag法（a）、酶法及酶聯合Sevag法（b）的蛋白脫除率Fig.1 Protein removal rates of Sevag method (a) and single enzymes and enzyme combined with Sevag deproteinization (b)

如圖1a所示，隨脫蛋白次數的增加，蛋白脫除率和多糖損失率均呈現上升趨勢，羥自由基的半清除率呈現下降趨勢。用Sevag法處理6 次后，蛋白脫除率為71.1%，多糖損失率為55.9%，羥自由基的半清除率為29.5%。表明在脫蛋白過程中，會損失部分多糖。

如圖1b所示，采用胃蛋白酶-Sevag法聯用脫蛋白，蛋白脫除率最高，達87.2%，但多糖損失率為15.9%，羥自由基半清除率為44.7%。酶法脫蛋白時，胃蛋白酶比木瓜蛋白酶脫蛋白效果好，采用胃蛋白酶脫蛋白的蛋白脫除率為86.0%，多糖損失率為3.7%，羥自由基半清除率為47.6%。雖然胃蛋白酶-Sevag法聯用的蛋白脫除率有小幅度的提高，但多糖損失率增大，并且Sevag試劑會對多糖的結構造成破壞，使多糖失去活性。胃蛋白酶法反應條件溫和，可將蛋白酶解成相對分子質量較小的多肽或氨基酸，醇沉后多肽及氨基酸保留在溶液中，大分子多糖得到沉淀，降低多糖的損失率。但由于少部分蛋白與多糖緊密結合形成糖肽或糖蛋白，導致任何一種脫蛋白工藝都不能將蛋白完全除去[29]。因此，為了更好地測定多糖的活性和結構，選擇胃蛋白酶脫除蛋白。此外，本實驗結果與葛炳艷[30]和陳桂冰[31]等的研究結果基本一致。

2.3 掃描電鏡分析

圖2 PGP和PGP-D的掃描電鏡形貌圖Fig.2 SEM images of PGP and PGP-D

如圖2所示，PGP（圖2a、b）和PGP-D（圖2c、d）的表面微觀形貌有較大差異。PGP具有顆粒感、整體呈球狀、表面粗糙凹凸不平、溝壑明顯，可能是由于PGP成分復雜，與蛋白結合緊密，相互包裹導致。經脫蛋白處理后，PGP-D呈現片狀、棱角分明、厚度均一、表面光滑緊密，說明成分相對均一，分子間相互作用力較強，放大至5 000 倍可見表面有輕微凹凸點。高倍下看到的僅是多糖的表面形貌，進一步的形態連接特征需借助更精密的儀器和設備。

2.4 單糖組成分析

如圖3a所示，混合標準品中各單糖的出峰順序依次為阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，其出峰時間依次為13.794、13.935、14.201、14.370、14.858、15.963、16.096、16.510、16.848、17.701 min和18.119 min。根據單糖標準品衍生化的保留時間鑒定PGP-D的單糖組成，如圖3b所示，PGP-D的單糖組成主要為阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，相對含量依次為8.0%、3.3%、7.3%、3.6%、4.5%和45.6%，表明PGP-D為酸性雜多糖。

圖3 單糖標準品（a）和PGP-D（b）的氣相色譜-質譜圖Fig.3 GC-MS profiles of mixed monosaccharide standard (a) and PGP-D (b)

2.5 紫外光譜分析

圖4 PGP-D的紫外-可見吸收光譜圖Fig.4 UV-visible absorption spectrum of PGP-D

如圖4所示，在波長190～400 nm內，PGP-D在波長200 nm處具有特征吸收峰，表明該樣品屬于多糖類物質；在波長260 nm處無吸收峰，表明不含核酸；在波長280 nm處有微弱吸收峰，表明經脫蛋白處理后，仍有少量蛋白與多糖緊密結合[32-33]，與脫蛋白工藝處理結果一致。

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

如圖5所示，樣品在3 300.20 cm-1處為O—H的伸縮振動峰[34]；在2 960.73、2 931.80、2 873.94 cm-1處為CH3、CH2的CH伸縮振動峰[34]；在1 392.61、1 309.67 cm-1為—COOH的C—O伸縮振動，證明存在糖醛酸結構[35]；1 109.07 cm-1處為C—O鍵伸縮振動峰[36]；在1 109.07～1 026.13 cm-1之間存在3 個拉伸峰，證明存在C—O鍵和吡喃糖環[37]；在904.61 cm-1處為β-糖苷鍵的特征吸收峰，表明該物質符合糖類結構[35]，是一種含有β-糖苷鍵的吡喃酸性雜多糖；在665.44 cm-1處為鼠李糖的特征吸收峰[35]。上述結果與氣相色譜-質譜、紫外光譜結果一致。

圖5 PGP-D的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectrum of PGP-D

2.7 體外抗氧化活性分析

2.7.1 羥自由基清除能力分析

圖6 PGP和PGP-D羥自由基清除能力Fig.6 Scavenging capacities of PGP and PGP-D on hydroxyl radicals

由于羥自由基很容易穿過細胞膜導致組織損傷或細胞死亡，因此，除去羥自由基對保護生命系統非常重要[38]。如圖6所示，多糖質量濃度與羥自由基清除率呈正相關，PGP對羥自由基的IC50值為2.8 mg/mL，PGP-D對羥自由基的IC50值為2.1 mg/mL，經脫蛋白處理后，多糖純度得到提高，使PGP-D清除羥自由基的能力優于PGP。與羅敬文等[39]從玉木耳中提取的多糖對羥自由基的IC50值為2.4 mg/mL，王姣等[9]從鮑內臟中獲得的多糖對羥自由基的IC50值為7.1 mg/mL，孫玉林等[40]發現擬目烏賊肌肉多糖對羥自由基的IC50值為12.4 mg/mL，相比活性較強。

2.7.2 總還原能力分析

圖7 PGP和PGP-D總還原能力Fig.7 Total reducing power of PGP and PGP-D

如圖7所示，隨質量濃度增加，PGP和PGP-D的還原能力均呈現上升趨勢。在質量濃度為10 mg/mL時，PGP的吸光度為2.100，PGP-D的吸光度為2.811，其中PGP-D是VC總還原能力的57.1%。經胃蛋白酶脫蛋白后，PGP-D表現出更強的還原能力。與宋蓀陽等[41]從扇貝性腺中提取的多糖，在質量濃度為10 mg/mL時吸光度為0.255，許女等[42]從雞腿菇子實體中提取的多糖，在質量濃度為8 mg/mL時吸光度為0.730，相比活性較強。

上述結果表明PGP-D可以作為抗氧化劑。研究認為，多糖的生物活性受其結構特征的影響，如原料、提取過程、單糖組成及糖苷鍵類型等方面的差異將導致抗氧化活性的不同[43-45]。首先，糖醛酸被認為是反映多糖抗氧化活性的重要指標。據報道，許多含有一定量糖醛酸的酸性多糖可作為優良的抗氧化劑[46-47]，這可能是因為在酸性多糖中存在親電基團，例如酮或醛，有助于從O—H鍵中釋放出氫[48]，由單糖組成分析可知，PGP-D中含有50.1%的糖醛酸（葡萄糖醛酸45.6%、半乳糖醛酸4.5%）。其次，揭示了單糖的組成和比例與抗氧化活性大小明顯相關。Meng Lei等[49]認為抗氧化活性與甘露糖和葡萄糖的含量相關，在PGP-D中，甘露糖相對含量為7.3%。有關葛氏鱸塘鱧多糖抗氧化活性機理鮮見報道，有待于進一步探討。

2.8 α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

圖8 PGP和PGP-D對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.8 Inhibition rates of α-glucosidase by PGP and PGP-D

餐后高血糖是II型糖尿病最早發生的代謝異常現象[50]。α-葡萄糖苷酶是寡糖降解為葡萄糖的關鍵酶，該酶是治療餐后高血糖的靶點。如圖8所示，多糖質量濃度與α-葡萄糖苷酶抑制效果呈正相關。當質量濃度為10 mg/mL時，陽性對照組阿卡波糖的抑制率為59.8%，PGP的抑制率為32.1%，是阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶能力的53.7%。而PGP-D對α-葡萄糖苷酶活性具有較弱的促進作用，這與黃霞[51]采用堿提法從杭白菊中提取的CMP-A多糖對α-葡萄糖苷酶的效果相似。

據Xu Ping等[50]報道，當蛋白質結合酸性雜多糖時，會對α-葡萄糖苷酶產生抑制作用，隨蛋白質含量的增加，抑制能力會得到改善，但其潛在的機制尚不清楚。

2.9 ACE活性抑制分析

圖9 PGP和PGP-D對ACE的抑制率Fig.9 Inhibition rates of ACE by PGP and PGP-D

ACE通過轉換腎素-血管緊張素系統中的血管緊張素I催化產生血管緊張素II，而血管緊張素II是一種導致高血壓的血管收縮因子。如圖9所示，多糖質量濃度與ACE抑制效果呈正相關性。在質量濃度為10 mg/mL時，PGP的抑制率為71.7%，PGP-D的抑制率為98.2%。與張夢娟[28]從天麻中獲得多糖的87.2%，Tan等[27]從苦瓜中提取多糖的94.1%相比，PGP-D表現出更強的ACE抑制能力。

3 結 論

本實驗優化的PGP脫蛋白方法為胃蛋白酶水解法，脫除率為86.0%，多糖損失率為3.7%，羥自由基半清除率為47.6%。PGP-D是一種含有β-糖苷鍵的酸性雜多糖，組成的單糖為阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，相對含量分別為8.0%、3.3%、7.3%、3.6%、4.5%和45.6%。PGP-D的總還原能力、對羥自由基清除能力及ACE的抑制能力優于PGP，且均呈量效正相關，PGP對α-葡萄糖苷酶具有抑制活性。