NaHCO3浸泡對反復凍融鮰魚肌肉品質的影響

章 蔚，焦春海，熊光權，汪 蘭，石 柳，李 新，丁安子，吳文錦,

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

斑點叉尾鮰（Ietalurus punetaus）屬鯰形目、鮰科魚類，具有食性雜、生長快、適應性廣、抗病力強等優點。鮰魚有著豐富的營養價值和特殊的風味，是最受消費者喜愛的魚類之一。斑點叉尾鮰的冷凍魚片是我國主要的水產品出口品種之一，因此，冷鏈技術對其生產應用至關重要[1]。

然而，目前的冷鏈技術還不夠完善，在水產品的長途運輸、貯藏和消費中因為溫度波動會不可避免地出現反復凍融的現象，導致其品質降低[2]。這一現象引起了國內外學者的廣泛關注，大量研究發現反復凍融會導致肌肉組織中水分的重新分布，使得大冰晶在細胞外形成，從而對肌肉組織造成嚴重的機械損傷，引起脂肪、蛋白氧化，最終造成肌肉品質的下降[3-8]。同時，有研究發現凍融循環過程中品質的劣變與其持水性下降有很大關系[2]，因此，開始有研究嘗試通過提高肉制品的持水性改善反復凍融對肉制品造成的不良影響。祝凱麗[9]、郭銳等[10]研究發現添加海藻酸鈉、磷酸鹽等保水劑對肉制品進行處理可以明顯改善肉制品的持水能力，保持肌肉的品質。另外有一部分研究認為pH值與其肌肉的持水性有很大的相關性[11]，通過添加NaHCO3對肉制品進行處理，發現添加NaHCO3可以提高產品的保水性，使其在凍藏過程中較高保留汁液[12-13]。因此，通過添加NaHCO3改善反復凍融過程中肉制品的品質有一定的可行性，但目前關于NaHCO3處理對淡水魚在凍融循環過程中的品質變化及其作用機制的研究仍鮮見報道。

本實驗通過測定經不同質量濃度NaHCO3浸泡后的鮰魚在多次凍融循環中的各項指標，研究NaHCO3浸泡對反復凍融中鮰魚肌肉品質的影響，旨在為水產品的保鮮技術發展提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鮰魚購于湖北省武漢市武商量販農科院店，平均質量約為1.8～2.0 kg，魚體魚鰭無破損，魚鰓鮮紅，魚眼飽滿黑白分明無渾濁。

鹽酸、氯化鈉、硫酸鉀、無水乙醇、硼酸、硫酸、三氯乙酸、鹽酸胍、氯化鉀、氫氧化鈉、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、尿素、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙醚、氫氧化鉀、二氯甲烷、甲醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、冰醋酸、牛血清蛋白（生化試劑）、考馬斯亮藍 美國Bio-Rad公司；三(羥甲基)氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）美國Sigma公司；2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、二硝基苯腙（dinitrophenylhydrazone，DNPH） 瑞士Fluka公司。

1.2 儀器與設備

818 pH計 美國奧立龍公司；BS-210電子天平 德國Sartorius Instruments有限公司；CR-400色差計 日本Minolta Camera公司；DGX-9143B電熱恒溫鼓風干燥箱上海雷磁儀器生產廠；GL-25MS高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；UV-2550分光光度計 日本島津公司；TGL20M臺式低速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；PHS-3BW酸度計 上海般特儀器有限公司；T18高速分散均質機 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將新鮮鮰魚在4 ℃條件下以敲頭方式擊殺，立即去除內臟、魚皮，用無菌生理鹽水沖洗干凈。取背部魚肉，切成4 cm×4 cm×2 cm，質量約20 g的魚塊。將鮰魚塊樣品分別置于質量濃度為0、0.5、1.0 g/100 mL的NaHCO3溶液中浸泡30 min，然后用濾紙快速將表面水分擦干，封裝于自封袋（4 cm×12 cm）。

處理后的樣品，在-35 ℃冷凍12 h后置于-18 ℃貯藏24 h。將貯藏后的樣品于4 ℃解凍12 h，記為凍融循環處理1 次的樣品。將標記后的樣品進行凍融循環處理，分別為1、2、4、7 次，新鮮樣品記為凍融循環0 次。

1.3.2 pH值的測定

使用便攜式pH計，將其探頭插入鮰魚魚肉中測定pH值。

1.3.3 解凍損失率的測定

稱取處理后的樣品的初始質量（m0），稱取解凍后用濾紙吸去表面水分的魚肉質量（m1），按照式（1）計算：

1.3.4 酸價的測定

參考GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛生標準的分析方法》中酸價滴定的方法進行測定[14]。計算公式如下：

式中：V為所用氫氧化鉀標準溶液的體積/mL；c為所用氫氧化鉀標準溶液濃度/（mol/L）；56.1為氫氧化鉀的摩爾質量/（g/mol）；m為試樣的質量/g。

1.3.5 TBA值的測定

參考何翠[15]的方法加以修改。取10 g絞碎魚肉樣品于凱氏蒸餾瓶中，加入20 mL蒸餾水、2 mL鹽酸溶液（HCl-H2O質量比1∶2）、2 mL液體石蠟混合均勻，進行水蒸氣蒸餾。取5 mL蒸餾液與5 mL 0.02 mol/L TBA溶液充分混合，100 ℃水浴加熱35 min后冷卻10 min，在535 nm波長處測吸光度A。計算如式（3）所示：

1.3.6 肌原纖維蛋白的提取和濃度測定

肌原纖維蛋白提取參考Yin Tao等[16]的方法；蛋白質濃度采用雙縮脲測定，牛血清蛋白作為標準蛋白。

1.3.7 總巰基與活性巰基的測定

參考賈丹[17]的方法加以修改。總巰基測定取1 mL質量分數0.4%的蛋白樣品溶液，加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0，含0.6 mol/L KCl和0.01 mol/L EDTA），室溫下放置30 min。活性巰基測定取取1 mL 0.4%蛋白樣品溶液，加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl，室溫下放置30 min。然后取4 mL上溶液，加入0.4 mL 0.1% DTNB（pH 8.0，0.2 mol/L Tris-HCl）混合均勻后于40 ℃水浴25 min，412 nm波長處測定吸光度。計算如式（4）所示：

式中：C0為蛋白質質量濃度/（mg/mL）；A為412 nm波長處的吸光度；D為稀釋倍數；ε為摩爾消光系數13 600 L/（mol·cm）。

1.3.8 羰基的測定

參照賈丹[17]的方法加以修改。取0.5 mL蛋白樣品溶液，加入2 mL DNPH溶液（10 mmol/L，用2 mol/L HCl溶解），另一管加入2 mL 2 mol/L HCl溶液作為對照，室溫下避光靜置1 h（每10 min渦旋）。隨后加入2.5 mL 20%三氯乙酸沉淀蛋白，11 000×g離心3 min，棄掉上清液后，用2 mL乙酸乙酯-乙醇溶液（1∶1，V/V）洗滌3 次，棄去上清液。加入6 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶解沉淀，室溫放置10 min后11 000×g離心3 min，取上清液，在370 nm波長處測定吸光度。計算如式（5）所示：

式中：C0為蛋白質質量濃度/（mg/mL）；A為370 nm波長處的吸光度；D為稀釋倍數；ε為摩爾消光系數22 000 L/（mol·cm）。

1.3.9 色度的測定

將待測鮰魚樣品魚肉切成1 cm×1 cm×1 cm的塊狀，用色度測定儀測定樣品的色度。白度按下式計算：

式中：L*為樣品的亮度；＋a*為樣品偏紅，-a*為偏綠；＋b*為樣品偏黃，-b*為樣品偏藍。

1.4 數據處理

實驗樣品分別從3 條魚體上取平行，重復測定3 次。數據使用Excel進行處理，采用SPSS 20.0進行差異顯著性分析，用GraphPad Prism 5.0和Excel進行作圖，用Origin 8.0進行線性方程擬合。

2 結果與分析

2.1 NaHCO3浸泡對反復凍融中鮰魚pH值的影響

圖1 NaHCO3質量濃度對反復凍融中鮰魚pH值的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaHCO3 on pH value with different freeze-thaw cycles

如圖1所示，未經NaHCO3浸泡的鮰魚肉pH值在前4 次凍融循環過程中無顯著差異，但在第7次凍融循環后從初始的6.87顯著下降至6.67；經0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰魚肉pH值經過4 次凍融循環后從初始的7.65顯著下降至6.81，然后基本保持穩定；經1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰魚肉pH值經過7 次凍融循環后從初始的8.04顯著下降至6.92。隨著凍融次數的不斷增加，魚肉的pH值顯著下降。已有研究表明，魚肉pH值在反復凍融過程中受諸多因素影響，魚體受糖酵解作用會發生乳酸的積累[18]；魚體內的蛋白質和脂肪在反復凍融過程中變性降解產生游離氨基酸和游離脂肪酸；蛋白質分子間、蛋白分子與水分子間的結合能力受離子化和表面電荷的影響而改變，從而影響pH值的變化[19]。在凍融過程中，經過NaHCO3浸泡后的鮰魚pH值均顯著高于未經NaHCO3浸泡組，且NaHCO3質量濃度越高，處理后的魚肉pH值越高。這是因為NaHCO3溶液呈堿性，它對凍融過程中魚肉pH值的降低有一定的緩沖作用。另外，研究發現，當凍融后期的pH值下降至肌肉蛋白等電點時，肌肉的持水性大大降低，從而導致水分的流失。當水分流失趨于飽和時，pH值的變化不再顯著[20]，這可能也是本實驗中凍融后期pH值變化趨于平緩的原因。

2.2 NaHCO3浸泡對反復凍融中鮰魚解凍損失率的影響

如圖2所示，鮰魚的解凍損失率在凍融循環前期顯著上升，在凍融循環中期基本保持穩定，然后在凍融循環后期顯著上升。經7 次凍融循環后，未經NaHCO3浸泡、經0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡、經1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰魚的解凍損失率分別顯著上升了12.89%、6.75%、6.48%。Jiang Qingqing[21]、Rahman[22]等研究發現肌肉的解凍損失率隨凍融循環的增大而增大，并發現解凍損失率與肌肉組織的微觀結構以及冰晶狀態有很大關系。鮰魚在反復凍融過程中蛋白變性使肌肉的微觀結構發生變化，從而導致持水性下降，水分慢慢流失直至飽和。隨著凍融循環次數的不斷提高，鮰魚會不斷地經歷冰晶的溶解-再形成過程，其肌肉細胞膜和細胞器在冰晶的機械力作用下不斷損傷并最終破裂，導致汁液的大量流失[23]。經NaHCO3浸泡后的鮰魚解凍損失率相較于未經NaHCO3浸泡的有了一定的降低，且經NaHCO3浸泡后的鮰魚解凍損失率在反復凍融過程中的上升速率明顯低于未經NaHCO3浸泡組，但不同質量濃度NaHCO3浸泡后的鮰魚肉間解凍損失率無顯著差異，說明NaHCO3浸泡能一定程度地維持魚肉在反復凍融過程中的持水性。

圖2 NaHCO3質量濃度對反復凍融中鮰魚解凍損失率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of NaHCO3 on thawing loss with different freeze-thaw cycles

2.3 NaHCO3浸泡對反復凍融中鮰魚脂肪氧化特性的影響

圖3 NaHCO3質量濃度對反復凍融中鮰魚脂肪氧化特性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of NaHCO3 on fatty oxidation with different freeze-thaw cycles

酸價和TBA值分別是判斷脂肪氧化的重要指標，酸價和TBA值越高，說明樣品的脂類腐敗越嚴重[24]。如圖3所示，不同質量濃度的NaHCO3浸泡后的鮰魚肉在反復凍融過程中酸價和TBA值均呈線性增長，對其進行數據擬合，得到不同質量濃度NaHCO3浸泡后脂肪氧化特性與凍融次數的線性方程見表1，各方程的擬合度均較高（R2＞0.9）。如圖3所示，經4 次凍融循環后，未經NaHCO3浸泡的魚肉TBA值達到15 μg/g，此時魚肉開始有明顯的劣變氣味，品質出現惡化，基本不能食用。另外，經過7 次凍融循環后，未經NaHCO3浸泡、經0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡、經1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰魚酸價分別顯著上升了25.2%、20.8%、23.3%，TBA值分別顯著上升了67%、64.8%、70.5%。反復凍融過程會使部分抗脂肪氧化的酶類失活；同時，反復凍融使魚肉類的冰晶分布發生變化，損壞了肌細胞的完整性，促使一些促氧化成分釋放[21,25-26]。另外，反復凍融過程中形成的冰晶會在樣品表面形成細微孔洞，脂肪與空氣的接觸面積增大，從而導致脂肪更易氧化酸敗[3]。常海軍[4]、陳麗麗[27]等通過研究發現，肉制品的TBA值隨凍融次數的增加而增大，說明反復凍融會加劇脂肪氧化程度。但經NaHCO3浸泡后，鮰魚肉酸價和TBA值均顯著降低。如表1所示，當未發生反復凍融時，經NaHCO3浸泡后的鮰魚肉酸價和TBA值相較于未經NaHCO3浸泡組明顯降低。同時，在反復凍融過程中，經NaHCO3浸泡后的鮰魚肉酸價和TBA值增長速率均低于未經NaHCO3浸泡組，說明NaHCO3浸泡能有效延緩魚肉在反復凍融過程中的脂肪氧化，且用1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡較0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡效果更好。

表1 不同質量濃度NaHCO3浸泡下鮰魚在反復凍融中脂肪氧化的線性方程與相關系數Table 1 Linear equation and correlation coefficients for fatty oxidation at different concentrations of NaHCO3 as a function of the number of repeated freeze-thaw cycles

2.4 NaHCO3浸泡對反復凍融中鮰魚蛋白特性的影響

蛋白質的溶解度與肌肉品質緊密相關，一般情況下，肌肉品質會隨著蛋白質溶解度的降低而下降[26]。如圖4所示，在前4 次凍融循環后鮰魚的蛋白質溶解度顯著下降，然后基本保持穩定。未經NaHCO3浸泡、經0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡、經1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰魚的蛋白質溶解度在7 次凍融循環后分別從初始的84.87、114.18、146.66 mg/g顯著下降至33.19、41.88、51.18 mg/g。Leygonie等[28]、李婉竹[29]通過研究發現蛋白溶解度隨凍融次數的增加而顯著下降。蛋白質在反復凍融過程空間結構發生變化，產生了二硫鍵、疏水鍵等，使得蛋白間的作用力加強、與水之間的結合力減弱[30]；另外，蛋白在反復凍融過程中氧化變性，從而發生聚合[27]，這些都會導致蛋白溶解度的下降。經過NaHCO3浸泡后，鮰魚的蛋白溶解度要顯著高于未經NaHCO3浸泡組，且在一定范圍內，NaHCO3質量濃度越高，蛋白質溶解度越高。Petracci等[31]認為，NaHCO3可以增強蛋白間的靜電排斥力提高其溶解度，從而降低剪切力。

圖4 NaHCO3質量濃度對反復凍融中鮰魚蛋白溶解度的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NaHCO3 on protein solubility with different freeze-thaw cycles

圖5 NaHCO3質量濃度對反復凍融中鮰魚蛋白氧化特性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NaHCO3 on protein oxidation with different freeze-thaw cycles

一般認為，巰基含量越低，羰基含量越高，蛋白變性程度越高[32]。如圖5所示，不同質量濃度的NaHCO3浸泡后的鮰魚肉在反復凍融過程中總巰基、活性巰基均呈線性下降，羰基含量呈線性增長，對其進行數據擬合，得到不同質量濃度NaHCO3浸泡后蛋白氧化特性與凍融次數的線性方程見表2，各方程的擬合度均較高（R2＞0.9）。如圖5所示，經7 次凍融循環后，未經NaHCO3浸泡、經0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡、經1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰魚總巰基含量分別顯著下降至0.089、0.09、0.10 mg/g；活性巰基含量分別顯著下降至0.040、0.050、0.063 mmol/g；羰基含量分別顯著上升至5.92、5.48、4.97 mmol/g，說明鮰魚在反復凍融過程中蛋白氧化程度加深。隨著凍融次數的增加，蛋白質氧化程度加深，活性氧自由基大量產生，使得蛋白質中的氨基酸發生脫氨反應向羰基轉化，羰基含量顯著提高。同時，凍融循環中蛋白質的空間結構發生變化，導致巰基向二硫鍵轉化，巰基含量顯著降低[32]。如表2所示，當未發生反復凍融時，經NaHCO3浸泡后的鮰魚肉總巰基和活性巰基含量相較于未經NaHCO3浸泡組顯著提高，羰基含量顯著下降。但在反復凍融過程中，經NaHCO3浸泡后的鮰魚肉總巰基含量較未經NaHCO3浸泡組下降速率加快，不同質量濃度的NaHCO3浸泡后的鮰魚肉活性巰基含量下降速率差異不大，而經NaHCO3浸泡后的鮰魚肉羰基含量上升速率明顯減慢。說明在反復凍融過程中，NaHCO3浸泡能提高蛋白質的溶解度和一定程度地延緩魚肉的蛋白氧化，且用1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡較0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡效果更好，但NaHCO3浸泡不能有效阻止甚至會加劇細胞的破壞，從而導致更多的二硫鍵暴露，使得巰基下降速率加快。

表2 不同質量濃度NaHCO3浸泡下鮰魚在反復凍融中蛋白氧化的線性方程與相關系數Table 2 Linear equations and correlation coefficients for protein oxidation at different concentrations of NaHCO3 as a function of the number of repeated freeze-thaw cycles

2.5 NaHCO3浸泡對反復凍融中鮰魚白度的影響

圖6 NaHCO3質量濃度對凍融循環過程中白度的影響Fig.6 Effects of different concentrations of NaHCO3 on whiteness with different freeze-thaw cycles

如圖6所示，未經NaHCO3浸泡后的魚肉白度經4 次凍融循環后從初始的52.75顯著下降至50.44，然后在第7次凍融循環后顯著回升至53.06，經0.5、1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡的魚肉白度經7 次凍融循環后分別從初始的54.53、56.89顯著下降至51.85、52.33。同時，經過NaHCO3浸泡的鮰魚肉白度值在前4 次凍融循環過程中顯著高于未經NaHCO3浸泡組，且NaHCO3質量濃度越高，處理后的魚肉白度值越高，但當凍融循環次數增加到7時，不同處理組間的差異顯著性消失。Jiang Qingqing等[21]通過研究發現，金槍魚在反復凍融后魚肉光澤逐漸消失，變得暗淡，并認為這是因為脂質氧化以及蛋白變性對光散射產生影響所致。在本實驗中，NaHCO3浸泡可以延緩脂肪氧化和蛋白變性，維持魚肉的持水性，因此可以一定程度的保持魚肉的色澤，但仍隨著凍融次數的增加而顯著下降。另外，未經NaHCO3浸泡的魚肉在后期凍融循環過程中白度值顯著增加，這可能是因為反復凍融使得冰晶狀態不斷發生變化，肌肉受機械破壞嚴重，大量水分滲出附著在魚肉表面，使光反射增加[33]，從而導致白度值的提高。

3 結 論

經過NaHCO3浸泡后，魚肉pH值、蛋白溶解度、總巰基含量、活性巰基含量、白度上升；解凍損失率、酸價、TBA值、羰基含量下降。隨著凍融次數的增加，魚肉的pH值、蛋白溶解度、總巰基含量、活性巰基含量、白度顯著下降；解凍損失率、酸價、TBA、羰基含量顯著上升，表明反復凍融導致魚肉的品質下降、脂肪氧化程度、蛋白變性程度增加。但在反復凍融過程中，NaHCO3浸泡后的鮰魚脂肪氧化速率和蛋白氧化速率要低于未經NaHCO3浸泡組，表明NaHCO3浸泡可以一定程度地抑制魚肉的脂肪氧化和蛋白氧化，保持魚肉的持水能力，從而有效地保持肌肉的品質，且1.0 g/100 mL較0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡組效果更好。因此可以通過NaHCO3浸泡保持鮰魚在加工保鮮過程中魚肉的肌肉品質。