TYP-5豬冷凍精液試劑使用方法

文│金穗華［農業部牛冷凍精液質量監督檢驗測試中心（南京）］

豬冷凍精液可以長期保存，能顯著提高種公豬利用率，擴大其基因傳播范圍，同時也是豬遺傳資源生物技術靜態保存的主要方法之一。在豬冷凍精液生產過程中，選擇合適的冷凍保護劑對改善解凍后精子復蘇率、活力、頂體完整率、存活時間、畸形率等精液質量指標至關重要。

自制豬冷凍精液試劑簡單方便，可以按照需要的數量隨時配制。自制試劑大多使用BTS（beltsville thawing solution）配方，該配方為EDTA 0.125克，檸檬酸三鈉0.6克，氯化鉀0.075克，碳酸氫鈉0.125克，葡萄糖3.7克，青霉素鈉0.06克，硫酸鏈霉素0.1克，純化水100毫升。應用BTS配方生產的冷凍精液解凍后精子復蘇率達到50%左右，頂體完整率能達到40%。

國內市面上效果較好、使用較多的豬冷凍精液保護劑為TYP-5田園奧瑞豬凍精試劑套裝。TYP-5田園奧瑞豬凍精試劑套裝2018年上市，性能穩定高效，所生產的豬冷凍精液復蘇率達到70%～90%，頂體完整率60%～80%，廣泛應用于豬冷凍精液商品化生產和地方品種豬冷凍精液保種。凍精試劑的正確使用方法和步驟至關重要，使用不當可能導致精子“全軍覆沒”。

一、TYP-5豬冷凍精液試劑介紹

1.TYP-5豬冷凍精液試劑組成。TYP-5豬冷凍精液試劑套裝含有A、B、C、D、E五種精液冷凍不同階段的成分，分別為：A為預稀釋劑、B為冷凍冷藏基礎營養液、C和D為冷凍輔助劑、E為解凍劑。B+蛋黃對應為冷藏保護劑、B+C+D+蛋黃對應為冷凍保護劑。其中，預稀釋劑和解凍劑為冷凍精液專用，有別于常溫豬精液稀釋粉（表1）。

表1 TYP-5豬冷凍精液試劑套裝組成表

二、TYP-5豬冷凍精液試劑使用方法

1.采精預稀釋。將豬凍精試劑A溶于1升雙蒸水中，充分混勻，預熱至37℃，將鮮采原精稀釋一倍。一袋豬凍精試劑A稀釋3～4頭份種公豬精液。同時，檢測原精質量，記錄密度、體積、活率（運動精子率）、活力（前向運動精子率）和畸形率，用于凍精的精液活率應在90%以上，活力在80%以上，畸形率在10%以下。（每袋豬凍精試劑A拆開后為成分不同、質量也不相同的A1和A2兩小包，必須同時使用）。

2.將稀釋后的鮮精于室溫（25℃）靜置1小時，轉入17℃恒溫箱，平衡2～3小時，最長不超過24小時。有條件的推薦使用程控平衡儀，可以程序化精準控制降溫溫度、降溫時間、降溫速率等。

3.將一瓶豬凍精試劑B溶于400毫升雙蒸水中，充分溶解，制成基礎液，稀釋6～8頭份種公豬精液。

4.取新鮮雞蛋，去蛋清，將完整蛋黃置于滅菌無絨吸水紙上，將剩余蛋清吸凈，用注射器抽取蛋黃100毫升，加入配好的基礎液中，充分混勻，制成I液。

5.取I液276毫升，加入豬凍精試劑C（18毫升），豬凍精試劑D（6毫升），制成Ⅱ液300毫升。

6.將I液置于17℃、Ⅱ液置于4℃恒溫箱冷藏，待用。

7.鮮精充分平衡后，搖勻，防止精子假死，17℃條件下800～900克離心10～15分鐘，去掉上清液。離心前記錄離心瓶重W0（克），去上清后，離心瓶加精子重W1（克），估得精子體積V1（毫升）=W1-W0。

筆者提出了一種新型綜掘巷道新型超前支護設備，具有高度和寬度可伸縮調整、適應不同巷道截面尺寸等功能，并利用特殊結構處理的伸縮梁與頂梁，使得支架在展開時能夠與頂板良好接觸。同時論述了該裝備的關鍵組成部分，即超前支架的結構及工作原理，并進行了應力分析，分析的結果為綜掘巷道超前支護提供了技術支撐。

8.用17℃的I液重懸浮精子，使精子密度達到20億/毫升。在離心較為徹底的情況下可以忽略上清中的精子，但若離心不徹底，上清精子較多，則總精子應該減去上清中的部分，即加入I液的體積V2＝原精總精子數（億）-上清液體積（毫升） ×上清液精子密度（億/毫升）/20（億/毫升）-V1（毫升）。若精清分離不徹底，可能會使V2/V1過小，甚至出現負值，影響精液后續的降溫，此時應調低凍精目標密度，或者重新離心，使得V2/V1≥1。

9.I液重懸浮后的精子置于盛有17℃水的燒杯中，于4℃冰箱或低溫操作柜中降溫平衡，注意用溫度計監測溫度，使精液在2.5～3小時緩慢降溫至4～5℃，并在4～5℃平衡0.5～1小時。有條件的推薦使用程控平衡儀，可以程序化精準控制降溫溫度、降溫時間、降溫速率等。

10.精液在4℃平衡后，加入Ⅱ液，稀釋一倍，其體積V3＝V1+V2。混勻后立即在低溫操作柜中進行0.5毫升細管灌裝操作，并在細管托架上碼好。

11.在精液進行0.5毫升細管灌裝的同時啟動程序冷凍儀，將腔室溫度降至4～5℃。另一邊同時將兩個水浴鍋分別設置50℃和30℃（26～32℃），并按照需要量每20毫升雙蒸水溶解1克豬凍精試劑E，于30℃（26～32℃）水浴鍋預熱備用。

12.灌裝完畢后，迅速將碼好的細管精液放入冷凍儀中，設置豬冷凍精液降溫曲線，啟動冷凍程序，待程序跑完后取出冷凍精液細管浸入液氮中。冷凍降溫速率控制在4℃至1℃為1.5℃/分鐘，1℃以后降溫速率達到-30℃/分鐘。如果使用熏蒸法手工制作，精液細管所在位置溫度控制在-120～-80℃。

三、TYP-5豬冷凍精液解凍劑使用方法

1.每頭豬至少取2支細管解凍進行檢測。細管在50℃解凍16秒，剪去細管兩端，將精液移入4毫升離心管中，用預熱好的解凍稀釋液稀釋。

2.冷凍精液在3 0℃（26～32℃）恢復15～20分鐘后在顯微鏡下檢測凍精解凍后質量。同時，根據解凍情況決定精液是否留存。

3.將決定留存的精液裝入拇指管和紗布袋中，轉入液氮罐儲存，并做好標記。標記信息至少包括日期和豬號。

4.輸精時，解凍精液用配好的解凍稀釋液稀釋約10倍，在30分鐘內進行子宮深部輸精，建議一個輸精劑量的有效精子總數不低于同等條件下的鮮精有效精子總數。

四、TYP-5豬冷凍精液試劑保存

1.儲存環境最好為陰涼干燥，避免高溫和潮濕。長期儲存2～8℃；短期儲存于室溫保存。

2.有效期。6個月。

五、TYP-5豬冷凍精液試劑使用注意事項

1.凍精試劑開封后盡快使用。

2.避免高溫和反復凍融。

3.使用新鮮雞蛋卵黃。

4.豬凍精試劑D冷藏會出現結晶，使用前可用30～40℃溫水加熱使之重新溶解。

受非洲豬瘟疫情及新冠肺炎疫情影響，豬鮮精運輸調配受阻和生物安全隱患影響到生豬生產的繁殖需求，豬冷凍精液長期保存的特點恰好可以有效彌補繁殖的短板。目前，豬冷凍精液技術研究越來越多并逐步進入商品化生產應用階段，科學配制更優化的冷凍精液試劑配方，提高精子抗氧化和抗凍耐凍能力，改善精子凍后活力質量，有助于豬冷凍精液的推廣應用，對加快恢復生豬生產、大力推動養殖業轉型升級具有重要意義和重大價值。