高效液相色譜串聯質譜測定雞、豬肉中萬古霉素

陳 竹

(上海天祥質量技術服務有限公司，上海 200030)

食品安全逐漸成為最近幾年各行各業最普遍關注的話題，增強食品檢驗，做好食品分析，在促進食品生產、管理和消費方面發揮著越來越重要的作用。目前萬古霉素作為抗生素被一些養殖者和飼料生產企業在動物飼喂過程中添加，該藥物可通過食物鏈進入人體，對人類生命構成了極大的威脅。目前萬古霉素有多種測定方法，每個方法都有自己合適的基質以及檢出限。比如色譜分析主要是根據混合物中不同物質的自身特性和相對運動來分離它們，以達到檢測的目的和效果。色譜分離法具有分析速度快、選擇性高、靈敏度高的特點，在食品檢測中普遍應用，且檢測質量相對較高。但是質譜法是在色譜分析的基礎上開發的。它不僅可以檢測食品中的農藥殘留，還可以進行色譜分析。這是鑒定純物質最有效的方法之一。質譜法主要用于確定分子量，確定化學式和確定物質的結構，并已廣泛用于臨床，食品測試和藥物生物化學領域。質譜分離效率高，檢測靈敏度高，非常適合食品檢測中農藥殘留的檢測。由于對樣品要求低、選擇性好、分離速度快，可以實現多組農藥的定性和定量分析，可以快速準確地分析農藥殘留的成分和組成，是檢測農藥和食品中的殘留物的好方法。在質譜的應用中，有許多檢測儀器。測試不同的物質時，必須選擇相應的儀器以確保測試的準確性。在食品檢驗中，有必要根據樣品和檢驗目的確定所需的檢驗設備，以使監測儀器的應用特性最大化。本實驗主要建立用LCMSMS測定雞肉豬肉中的萬古霉素。

1 實 驗

1.1 試劑耗材[1]

Waters TQ-S高效液相色譜串聯質譜(配有電噴霧離子源)；Eppendorf高速冷凍離心機(8000 r/min)；分析天平(精確到0.1 mg)；分析天平(精確到0.01 mg)；超聲波清洗器，科導；渦旋混勻器；均質器；氮吹濃縮儀；SUPELCO固相萃取裝置；Waters-60 mg/3 mL或等效陽離子交換柱(MCX)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 μm*100 mm,1.7 μm)；乙腈 HPLC級；甲醇HPLC級；氨水AR級；甲酸AR級；甲酸HPLC級；乙酸銨HPLC級；三氯乙酸AR級；微孔濾膜0.22 μm有機濾膜。

1.2 標準品配置及儲存[2]

標準物質名稱：萬古霉素；標準物質英文名稱；vancomycin；標準物質CAS號：1404-92-6。

標準儲備液：市售100 μg/mL，-18 ℃儲存，有效期12個月；一級標準中間液 (1.0 μg/mL)：準確移取50 μL儲備液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，4 ℃儲存，有效期6個月；二級標準中間液 (100 ng/mL):準確移取100 μL一級標準中間液于1 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，4 ℃儲存，有效期3個月。

曲線配置：線性范圍1.0～20.0 ng/mL，用陰性樣品基質溶液定容。

1.3 樣品前處理[3]

提取：準確稱量稱取2 g(精確至0.1 mg)雞肉或豬肉樣品，加入5 mL 5%三氯乙酸：乙腈(4：1)溶液，渦旋混勻2 min，水浴超聲15 min(注意超聲儀水溫不宜過高)，8000 r/min冷凍離心5 min，重復上述提取操作，合并提取液于10 mL容量瓶中，用5%三氯乙酸：乙腈(4：1)溶液定容至刻度線，充分渦旋混勻2 min，待凈化。

凈化：將Waters MCX柱安裝好，依次用5 mL甲醇，5 mL 0.1%甲酸水溶液活化，準確移取2 mL待凈化樣液過柱，流速控制在0.3 mL/min，樣液滴完后用5 mL甲醇淋洗，6 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃氮吹至干，用1 mL 0.1%甲酸水溶液復溶，過0.22 μm微孔濾膜后，供高效液相色譜串聯質譜儀器測定。

1.4 高效液相色譜條件[4]

色譜柱：Waters Xbridge BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；

流動相：A相為乙腈，B相為0.1%甲酸5 mmol乙酸銨溶液;

流速：0.3 mL/min；

進樣量：5 μL；

柱溫：45 ℃。

表1 液相方法流速及梯度

1.5 質譜條件[5]

離子源：電噴霧離子源(ESI)；

檢測方式：多反應離子監測(MRM)；

掃描方式：正離子模式；

離子源溫度：150 ℃；

噴霧電壓：3.5 kV；

錐孔電壓：38 V；

脫溶劑氣溫度：450 ℃；

脫溶劑氣流速：800 L/Hr。

1.6 監測離子對參數[6]

表2 萬古霉素質譜信息

2 結果與討論

2.1 實驗圖譜

圖1為萬古霉素標品圖，圖2為萬古霉素曲線線形圖，圖3為雞肉空白樣品圖，圖4為雞肉檢出限加標圖。

圖1 萬古霉素標品圖

圖2 萬古霉素曲線線形圖

圖3 雞肉空白樣品圖

圖4 雞肉檢出限加標圖

2.2 實驗注意事項

(1)實驗過程要有平行試驗，空白實驗，加標實驗作為質控。

(2)按照確定的液相色譜-質譜/質譜條件測定樣品和標準工作溶液，響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內，以色譜峰面積外標法定量，正離子掃描模式。

(3)被測組分選擇1個母離子，2個子離子，在相同實驗條件下，試樣中待測物質的保留時間與標準工作溶液中對應的保留時間偏差在±2.5%之內，且試樣譜圖中各組分定性離子的相對豐度于標準工作溶液中定性離子的相對豐度，其允許偏差不超過下表規定的范圍時，則可確定為樣品中存在這種待測物。

定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差見表3。

表3 離子豐度比參考表

2.3 討 論

質譜法是在色譜分析的基礎上開發的。它不僅可以檢測食品中的農藥殘留，還可以進行色譜分析。這是鑒定純物質最有效的方法之一。質譜法主要用于確定分子量，確定化學式和確定物質的結構，并已廣泛用于臨床，食品測試和藥物生物化學領域。質譜分離效率高，檢測靈敏度高，非常適合食品檢測中農藥殘留的檢測。但是在實驗過程中，發現按照提取劑比例不同，目標物及基質被萃取的也不同[2]，此次實驗過程主要是在降低基質干擾提高回收率，例如提取劑的比例，不同比例萃取效果不一樣，比如上樣體積，上樣體積越多，即使我淋洗液再多，它的基質干擾很強，本底噪音很高，于是嘗試了減少樣品量，在儀器響應能滿足的情況下減少基質干擾，從而達到效益最大化。在保證標品的響應沒有問題的前提下，再優化前處理，是此次嘗試減少上樣體積的原因。

3 結 論

本文參考較多的萬古霉素相關文獻資料建立了適合豬肉、雞肉的萬古霉素檢測方法。所涉及的色譜柱流動相為實驗室常見類型這點較為方便，只是對于提取劑的要求較高，并且適用基質不是那么全面。正常實驗條件下，回收率均在75%及以上，回收率穩定偏上。實驗前處理簡單且儀器分析時間較短，較為適合樣本量較大的實驗室。