HPLC-MS法測定黃芪中黃酮類成分的含量

陳春茗，龔 姍，陳 蕾，馬丹鳳

(1 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2 湖南省兒童醫院，湖南 長沙 410007)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補氣固表、利尿消腫、斂瘡生肌等功效，在表虛自汗、陰虛盜汗、陽氣虛弱、肺氣虛、中氣下陷、食少便溏、子宮脫垂等癥上有較高藥用價值[1-2]。現代藥理研究表明，黃芪含有皂苷類、黃酮及多糖類成分，具有增強免疫功能、調節血壓、抗菌、抗病毒、清除氧自由基、保護血管內皮功能、保肝、抗心肌缺血等多種藥理作用[3-4]。黃芪藥材中可分離出幾十余種黃酮類成分，常見的有槲皮素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、染料木苷等[5-6]。本研究采用HPLC-MS法測定了黃芪藥材中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素等4種含量較高的黃酮類成分含量，以期為黃芪藥材質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

API4000型三重四級桿質譜，美國應用生物系統；1100型液相色譜儀，美國安捷倫公司；AL204型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；DL-360D超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司。

1.2 試 藥

毛蕊異黃酮苷對照品(批號：15111012)、芒柄花苷對照品(批號：15041223)、毛蕊異黃酮對照品(批號：15090324)、芒柄花素(批號：15080717)均購買自廣州牌牌生物科技有限公司，純度均>98%；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，購自美國邁瑞達科技有限公司；水為去離子水。8批黃芪藥材來源于不同產地，經筆者鑒定均為蒙古黃芪，見表1。

表1 黃芪藥材來源與品種

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Acclaim 120 C18，戴安公司，2.1×100 mm，5 μm；流動相：乙腈(A)-0.3%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，18%～20% A；10～35 min，20%～24% A；35～52 min，24%～27% A；52～60 min，27%～34% A；60～65 min，34%～40% A；65～70 min，40%～50% A)；流速：1.0 mL/min；柱溫：檢測波長254 nm，進樣量：20 μL，柱溫25 ℃。HPLC圖譜如圖1所示。

2.2 質譜條件

離子模式：電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓：241 kV；離子源溫度：350 ℃；以氮氣為干燥氣，流速為1.5 L/min。掃描模式為選擇離子監測(SIM)，定量分析監測離子有毛蕊異黃酮苷m/z 445.11[M-H]-、芒柄花苷m/z 429.12 [M-H]-、毛蕊異黃酮m/z 283.06[M-H]-、芒柄花素m/z 267.07[M-H]-。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液

精密稱定各待測成分對照品適量，加甲醇溶解，搖勻，制成混合對照品溶液，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素質量濃度分別為0.22、0.13、0.07、0.05 mg/mL。

2.3.2 供試品溶液

取樣品適量，粉碎(過4號篩)，精密稱定1.0 g，加甲醇100 mL，回流提取1.5 h，減壓濃縮，轉移至5 mL量瓶，以甲醇定容至刻度，充分搖勻，再用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

3 結果與討論

3.1 系統適用性實驗

取“2.3.1”項下配制混合對照品溶液適量，進樣測定(按“2.1”項色譜條件)，得到HPLC圖譜，見圖1。結果顯示，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素保留時間分別為9.24 min、26.08 min、38.56 min、65.73 min，各成分均達到基線分離，峰形良好，理論板數均>1.5。

圖1 混合對照品(A)和供試品(B)的HPLC圖譜

3.2 線性關系考察

分別精密量取“2.3.1”項下混合對照品溶液1、5、10、50 μL，進樣測定(按“2.1”項色譜條件)，記錄峰面積。以待測成分質量濃度(x,mg/mL)為橫坐標，以峰面積(y)為縱坐標，做線性回歸，得回歸方程、線性范圍，見2。

表2 回歸方程及線性范圍

3.3 精密度實驗

取“2.3.1”項下配置的混合對照品溶液適量，進樣測定(按“2.1”項色譜條件)，連續進行6次測定，記錄峰面積并分析，結果顯示，毛蕊異黃酮苷RSD為0.23%，芒柄花苷RSD為0.56%，毛蕊異黃酮RSD為0.37%，芒柄花素RSD為0.18%，說明該方法具有良好精密度。

3.4 穩定性實驗

取“2.3.2”項下配制的供試品溶液適量，室溫下放置，并分別于0、4、8、12、18、24 h進行測定(按“2.1”項色譜條件)，分析峰面積并分析，結果顯示，毛蕊異黃酮苷RSD為0.15%，芒柄花苷RSD為0.27%，毛蕊異黃酮RSD為0.41%，芒柄花素RSD為0.22%，說明供試品溶液在室溫下放置24 h具有良好穩定性。

3.5 重復性實驗

配制供試品溶液(按“2.3.2”項相關方法)，共制備6份，進樣測定，色譜條件按“2.1”項，記錄峰面積并進行含量測定。結果顯示，毛蕊異黃酮苷含量為0.4212%，RSD為0.0842%；芒柄花苷含量為0.5187%，RSD為0.7923%；毛蕊異黃酮含量為0.2269%，RSD為0.0768%；芒柄花素含量為0.6582%，RSD為0.9228%；說明該方法具有良好重復性。

3.6 加樣回收率實驗

取已知含量的樣品約0.5 g，共6份，并分別加入一定量待測成分對照品，配制供試品溶液(按“2.3.2”項下方法)，進樣測定(按“2.1”項下色譜條件)，計算加樣回收率，見表3。

表3 加樣回收率試驗(%)

3.7 樣品測定

8批黃芪藥材，各取適量，配制供試品溶液(按“2.3.2”項下方法)，進行測定(按“2.1”項下色譜條件)，記錄峰面積，計算各黃酮成分含量。見表4。

表4 黃芪藥材中黃酮成分含量測定結果(n=3，mg/g)

3.8 檢測方法選擇

在前期條件摸索過程中，嘗試以HPLC-DAD法測定黃芪中黃酮類成分含量，發現黃芪中芒柄花苷與毛蕊異黃酮等成分相互干擾不能實現完全分離。而HPLC-MS法選擇性及靈敏度均較好，同時不要求待測成分達到完全分離，這對分析含有多種有效成分的中藥有著明顯優勢[7]，因此選擇HPLC-MS法測定黃芪藥材中黃酮成分含量。本研究應用的SIM模式較多反應監測模式專屬性要低，使得一些待測成分在獲取的離子流圖中可出現多個色譜峰。對此，試驗中測定了成分色譜峰的保留時間，以解決這一不足。

3.9 質譜條件優化

在待測成分的質譜條件選擇優化過程中發現，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素等負離子檢測模式下響應較好，故而選擇負離子模式對黃芪中藥中上述四種黃酮成分含量進行測定。

3.10 流動相考察

黃芪中黃酮類成分多呈弱酸性，因此應選擇酸性緩沖系統[8]，本研究分別對乙腈-磷酸、乙腈-甲酸系統進行了考察，發現抑制劑選用甲酸，黃酮各成分能夠得到較好分離。同時還評估多種梯度流動相配比，結果發現，以乙腈(A)-0.3%甲酸溶液(B)為流動相系統，梯度洗脫(0～10 min，18%～20% A；10～35 min，20%～24% A；35～52 min，24%～27% A；52～60 min，27%～34% A；60～65 min，34%～40% A；65～70 min，40%～50% A)時4種黃酮類成分分離效果最好，色譜峰間分離度均在1.5以上，因而選擇乙腈-0.3%甲酸溶液為流動相。

3.11 提取方法選擇

有報道指出，在黃芪總黃酮提取上，連續回流提取法較超聲法有著節省溶劑、操作迅速、獲取有效成分高等多種優勢[9]。本研究觀察評估了超聲法、冷浸法、回流法等三種提取方法，發現回流提取明顯優于其他兩種提取方法。此外，本研究還就不同提取時間進行了考察，發現回流1.5 h后，隨著回流繼續進行，毛蕊異黃酮、芒柄花素的峰面積逐漸減小，提示上述兩種黃酮成分可能具有熱不穩定性。故選擇回流提取1.5 h進行黃芪中黃酮成分的提取。

3.12 檢測波長選擇

有研究顯示，毛蕊異黃酮苷與毛蕊異黃酮的最大吸收波長為258 nm，而肩縫處于288 nm波長；芒柄花苷、芒柄花素最大吸收波長為248 nm，而肩峰處于290 nm[10-11]。采用二極管陣列檢測器全波長對供試品溶液進行掃描，獲取指紋圖譜，以盡可能涵蓋所有吸收峰為原則，發現各黃酮類成分在254 nm時，峰形及峰面積較好，因此選擇254 nm為檢測波長。

4 結 論

本研究建立HPLC-MS法同時測定黃芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素等黃酮類成分，具有較高的精密度、穩定性、重復性，且該法操作簡便、迅速，可作為黃芪藥材中黃酮類成分含量測定的質控手段。