橘紅配方顆粒質量標準研究*

藥雅俊，張府君，郝晶晶，甄會賢

(山西藥科職業學院，山西 太原 030031)

橘紅來源于蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥外層表皮。秋末冬初果實成熟后采收，用刀削下外果皮，然后曬干或陰干。橘紅近年來在中藥應用中逐漸廣泛，研究發現，其含有揮發油[1]，黃酮類等化學成分[2]。且其含有的橙皮苷具有抑菌、抗炎和抗病毒、增強維生素C作用、對胃腸功能及平滑肌作用[3]、抑制皮膚色素沉著、抗癌作用、防止骨質疏松、預防心血管病、抗羥自由基氧化、對中樞神經系統的影響、降低膽固醇、治療風濕[4]等藥理作用。而中藥配方顆粒質量穩定、儲存和攜帶方便，更便于臨床使用[5]。因此，橘紅配方顆粒的開發研究具有重要意義。本實驗通過對橘紅配方顆粒質量標準的研究，為橘紅配方顆粒的規范化制備和質量標準提供依據。

1 儀器與藥品與試劑

1.1 實驗儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters2998檢測器，Empower色譜工作站，美國沃特世公司；WD-9403C紫外儀，北京六一生物科技有限公司；CP214型電子分析天平(萬分之一)，上海舜宇平科學儀器有限公司；AB135-S電子天平(十萬分之一)，瑞士METTLER公司；SB-5200 DTDN 超聲波清洗器，寧波新藝生物科技股份有限公司；RE-5205旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SB-800 DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；YC-015噴霧干燥機，上海雅程儀器設備有限公司。

1.2 藥品與試劑

橘紅飲片，購置于萬民藥房，經山西藥科職業學院甄會賢副教授鑒定為《中國藥典》(2015版)收載品種；硅膠G板(批號：20161102)，青島海洋化工廠分廠有限公司；橘紅對照藥材(批號：111695-201608)，橙皮苷對照品(含量測定用，批號：110721-201617)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，批號：Lot No 161104290004)，瑞典歐森巴克化學公司；乙腈(色譜純，批號：Lot No.12960217)，瑞典歐森巴克化學公司：娃哈哈純凈水。其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 橘紅配方顆粒的制備工藝

稱取橘紅飲片適量，加水浸泡60 min，加熱回流提取2次，每次1 h，第一次加12倍量水，第二次加12倍量水。濾出藥液，合并濾液。將濾液置旋轉蒸發儀中于60 ℃減壓濃縮至相對密度為1.05～1.10，噴霧干燥(參數：進風溫度200 ℃；出風溫度60 ℃；進樣流速8.0 mL/min)，即得。

2.2 質量標準研究

2.2.1 薄層色譜鑒別

取本品粉末0.5 g，加甲醇10 mL，加熱回流20 min，濾過，取濾液5 mL，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取橘紅對照藥材1.0 g，同法制得對照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗[5]，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)為展開劑，展開約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，如圖1所示。

圖1 橘紅配方顆粒薄層色譜圖

2.2.2 指紋圖譜的初步研究

(1)流動相的考察

表1 梯度洗脫條件

根據參考文獻，選擇甲醇-水等度洗脫考察，結果發現在等度洗脫條件下均不能實現同時分離，因此采用梯度洗脫的方法。本實驗在參考文獻[6]的基礎上對流動相乙腈(A)-甲醇(B)-0.1%磷酸溶液(C)的梯度變化進行了考察，梯度洗脫條件見表1、表2，結果見圖2、圖3。綜合考慮后調整為表2的梯度洗脫條件，該條件下，供試品出峰，各成分達到基線分離，峰型對稱，分離效果相對最好，結果見圖3。

圖2 橘紅配方顆粒HPLC圖(表1條件)

表2 梯度洗脫條件

圖3 橘紅配方顆粒HPLC圖(表2條件)

(2)指紋圖譜的建立

①色譜條件。色譜柱：BDS HYPERSIL C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，甲醇為流動相B，0.1%磷酸溶液為流動相C，按表2進行梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：324 nm；進樣量：10 μL。

②參照物溶液的制備。取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

③供試品溶液的制備。取本品粉末(過四號篩)約0.2 g，精密稱定，加甲醇20 mL，加熱回流1 h，放冷，轉移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器和殘渣，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

④測定法。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄60 min的色譜圖，即得。得到7個共有指紋峰，各共有峰之間分離度良好，通過與對照品圖譜比較，3號峰即為橙皮苷，結果見圖4、圖5。

圖4 橙皮苷對照品溶液HPLC圖(3 橙皮苷)

圖5 橘紅配方顆粒HPLC指紋圖譜圖(3橙皮苷)

2.2.3 含量測定

①色譜條件。色譜柱：BDS HYPERSIL C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-水(40：60)為流動相；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：284 nm；進樣量：10 μL。

②供試品溶液的制備。同“2.2.2 (2)指紋圖譜的建立”項下“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液。

③對照品溶液的制備。取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

④系統適用性試驗。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀測定(對照品溶液連續進樣6次)，考察系統適用性，結果理論塔板數為2100(理論板數按橙皮苷峰計算應不低于 2000)、重復性RSD=0.3%、分離度3.56、對稱因子1.03,均符合要求。橙皮苷對照品色譜圖、橘紅飲片色譜圖及橘紅配方顆粒色譜圖見圖6～圖8。

圖6 橙皮苷對照品HPLC圖(1橙皮苷)

圖7 橘紅飲片HPLC圖(1橙皮苷)

圖8 橘紅配方顆粒HPLC圖(1橙皮苷)

⑤樣品含量測定。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀測定，按外標一點法計算各樣品橙皮苷的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果

3 結 論

指紋圖譜色譜方法的建立過程中發現等度洗脫條件下難以實現同時分離，因此采用梯度洗脫的方法。本實驗在文獻的基礎上對流動相梯度洗脫條件進行了考察，最終發現以甲醇、乙腈、和0.1%磷酸水溶液按表2梯度洗脫[6]，在該條件下橘紅中的各成分達到基線分離，峰形對稱，分離效果較好，可作為橘紅配方顆粒的HPLC指紋圖譜的色譜條件，為后期規范的指紋圖譜建立奠定基礎。

供試品制備方法的考察中對比了加熱回流和超聲提取兩種方法，結果發現加熱回流提取得到的供試品溶液色譜峰之間分離度良好，可作為橘紅配方顆粒指紋圖譜的供試品提取方法。另外還對檢測波長進行了考察，實驗同時考察了283 nm[7]及其他波長下的響應值，通過綜合比較發現在324 nm處每個峰響應值最好。所以本實驗將324 nm作為檢測波長。

本實驗采用的含量測定及指紋圖譜方法簡便可行、準確、快速，樣品處理步驟及色譜條件簡單，方法可靠。可用于橘紅配方顆粒的質量控制。