高效液相色譜法用于小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測(cè)與去除的研究*

關(guān)嘉成，苗 力，盧 杰，徐雅晴，于純純 ，徐勝偉

(1 淮南師范學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 淮南 232038； 2 國(guó)家煤化工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，安徽 淮南 232001)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，其總產(chǎn)量和消費(fèi)量位居世界首位[1]。我國(guó)小麥產(chǎn)量約占世界小麥總產(chǎn)量的20%，以小麥為主食的人口占全國(guó)40%，因此小麥及其制品的質(zhì)量安全事關(guān)廣大人民群眾的食品安全[2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)主要由禾谷鐮刀菌及黃色鐮刀菌產(chǎn)生，是一種真菌毒素，俗稱嘔吐毒素，在小麥、大麥、玉米及其制品中較為常見，而小麥被DON污染的程度居于首位[3-4]。誤食被DON毒素污染的小麥制品會(huì)出現(xiàn)厭食、惡心、手足發(fā)麻、呼吸急促等急性癥狀，長(zhǎng)期食用，DON會(huì)在人體蓄積，產(chǎn)生損害肝臟、心臟、腎臟等器官的慢性毒性，嚴(yán)重危害人體健康[5]。開展市售小麥及其制品中DON檢驗(yàn)事關(guān)生產(chǎn)廠家聲譽(yù)和廣大人民群眾食品安全，因此我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》(GB2761-2017)中規(guī)定DON在谷物中的最大限量值為1000 μg/kg，為市售小麥粉質(zhì)量監(jiān)控檢測(cè)工作提供了法律依據(jù)[6]。

由于霉菌無處不在，目前要完全消除小麥和小麥制品中的DON是不可能的。遵循優(yōu)良的務(wù)農(nóng)及加工規(guī)范，可減少受DON污染的機(jī)會(huì)。而對(duì)于受污染的小麥及其制品，采用物理化學(xué)方法處理可有效減少DON的含量。物理方法有物理分級(jí)，水洗法，物理吸附等，化學(xué)方法有臭氧降解，加入添加劑等。張來林等[7]通過采用新型比重式精選機(jī)對(duì)赤霉病小麥進(jìn)行清理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與未清原糧相比，初清后原糧和精選后原糧DON含量分別降低73.9%和154.8%，小麥中DON含量顯著下降。袁向星等[8]發(fā)現(xiàn)將DON含量較高的面粉經(jīng)水洗分離制成淀粉和谷朊粉后，可將DON超標(biāo)的面粉降至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以下。李榮佳等[9]采用一種新型復(fù)合吸附劑HG對(duì)DON進(jìn)行吸附，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其平均吸附率為28.08%。王莉等[10]采用臭氧降解小麥中的DON，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小麥中水分含量越高其去除效果越好。常敬華[11]通過在和面中加入1%的Na2CO3制成的干掛面，再煮制面條，可以加速DON毒素的降解，很好地減輕其毒性。因此DON污染的小麥通過物理化學(xué)方法脫毒對(duì)提高小麥及其制品的質(zhì)量安全具有重要意義。

食品中DON的檢測(cè)方法有同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、薄層色譜測(cè)定法和酶聯(lián)免疫吸附篩查法4種方法[12]。因免疫親和層析凈化高效液相色譜法具有高速、高效、高靈敏度、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)[13-14]，故本文采用該法，并以《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》(GB5009.111-2016)為依據(jù)，將小麥樣品在0.1 mol/L的Na2CO3溶液中浸泡48 h后，進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比分析，旨在為小麥中DON的檢測(cè)及去除工作提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀 器

SPD-M20A島津高效液相色譜儀，島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司；電子天平(感量0.00001 g和0.01 g)，上海析平科學(xué)儀器有限公司；TG20WS高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；HN5-150A超聲波，上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司；KL-UP艾柯超純水機(jī)，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；移液槍(10～100 μL，100～1000 μL)，北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HK-04A高速粉碎機(jī)，濟(jì)南旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司；HNDK200-1氮吹儀，上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司；玻璃注射器(10 mL)，姜堰區(qū)康達(dá)實(shí)驗(yàn)器材廠。

1.1.2 材 料

DON免疫親和柱(載量≥1000 ng)，青島普瑞邦生物工程有限公司；玻璃纖維濾紙(Grade 934-AH)，上海駟芮科技有限公司；水相微孔濾膜(0.45 μm)，上海興亞凈化材料廠；8種市售小麥樣品。

1.1.3 試 劑

甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；聚乙二醇；氯化鈉；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鉀；氯化鉀；鹽酸；標(biāo)準(zhǔn)品：脫氧雪腐鐮刀鐮刀菌烯醇(C15H20O6，CAS號(hào)：51481-10-8)，純度≥99%。

1.1.4 儀器工作條件

檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；色譜柱為C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇+水=20+80；流速為0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm，進(jìn)樣量：50 μL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

本實(shí)驗(yàn)在已檢測(cè)出DON的小麥中選取8種DON不同含量的小麥進(jìn)行去除對(duì)比分析。

將8種小麥分成兩組，一組用碾米機(jī)脫皮后，再用磨粉機(jī)粉碎，收集面粉待測(cè)，依次編號(hào)為A-1，B-1，C-1，D-1，E-1，F(xiàn)-1，G-1，H-1；一組分別浸泡在0.1 mol/L碳酸鈉溶液(樣品重：溶液體積=1：10)中48小時(shí)，然后用超純水清洗，曬干后依次進(jìn)行脫皮、粉碎，面粉收集待測(cè)，依次編號(hào)為A-2，B-2，C-2，D-2，E-2，F(xiàn)-2，G-2，H-2[15]。

1.2.2 提 取

在100 mL具塞三角形中準(zhǔn)確加入25.0 g小麥粉、5 g聚乙二醇和100 mL水，混勻后超聲20 min。將溶液用玻璃纖維濾紙過濾至澄清，收集濾液于離心管中，離心5 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為10000 r/min。

1.2.3 凈 化

將免疫親和柱恢復(fù)至室溫，當(dāng)原有的液體流盡免疫親和柱后，準(zhǔn)確移取上述濾液2.0 mL于玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)下滴速度，讓樣液以1滴每秒的流速通過免疫親和柱。待液體排干后，分別用5 mL PBS緩沖鹽溶液和5 mL水淋洗免疫親和柱，液體以1～2滴每秒的速度流出，待空氣進(jìn)入免疫親和柱中后，抽干小柱。

1.2.3 洗 脫

準(zhǔn)確加入2 mL甲醇洗脫免疫親和柱，流速約為1滴每秒，收集全部洗脫液于試管中，在50 ℃下，用氮?dú)饩徛貙⑵浯抵两伞＜尤?.0 mL初始流動(dòng)相，渦旋30 s溶解殘留物，用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，將濾液收集于進(jìn)樣瓶中，用于高效液相色譜分析。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取1 mg DON，用乙腈溶解后定容于10 mL容量瓶中。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用初始流動(dòng)相配制成100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)DON 100～5000 ng/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜分析，得出其分析圖譜，如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜分析圖

對(duì)濃度分別為100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，根據(jù)其濃度和對(duì)應(yīng)出峰面積的線性關(guān)系作圖，如圖2所示。線性回歸方程為y=77.682x-1505.7，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，表明采用高效液相色譜法對(duì)DON進(jìn)行測(cè)量線性效果好。

圖2 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 小麥樣品中DON含量去除前后對(duì)比

將去除DON前后的小麥樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1和表2所示。

表1 小麥中DON含量的檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，在檢測(cè)的8組小麥粉樣品中，有6組DON含量高于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的1000 μg/kg，小麥粉A-1中DON含量最高1958 μg/kg。兩組小麥粉樣品均在1000 μg/kg以下，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其中小麥粉H-1中DON含量最低為912 μg/kg。

表2 Na2CO3處理后的小麥粉中DON去除率

由表2知，0.1 mol/L的Na2CO3對(duì)小麥中的DON具有很好的去除效果，可以將DON含量超標(biāo)的小麥粉降至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1000 μg/kg以下。其中最高降低率高達(dá)76.2%，最低降低率67.3%，平均降低率為71.5%。隨著小麥粉中DON的含量的減少，去除率逐漸增加。

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜法對(duì)小麥粉中DON含量進(jìn)行檢測(cè)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線知，線性回歸方程為y=77.682x-1505.7，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。高效液相色譜法具有線性范圍寬、高速、高效等優(yōu)點(diǎn)，適合小麥及其制品中DON的檢測(cè)。8種小麥粉中共檢測(cè)出6種超標(biāo)，在0.1 mol/L的Na2CO3溶液中浸泡后，6組原超標(biāo)小麥粉的DON含量均降低至1000 μg/kg以下。兩組未超標(biāo)的小麥經(jīng)處理后，DON去除率顯著升高，去除率高達(dá)76.2%，8組小麥粉DON平均降低率為71.5%。本研究對(duì)小麥及其制品中DON含量的準(zhǔn)確、快速檢測(cè)及其去除具有一定的參考價(jià)值。