卡那霉素修飾醋酸纖維素膜的制備及應用*

胡夢婷，曾惠琴，黃 露

(閩江學院海洋學院化學工程系，福建 福州 350108)

手性是自然界的本質屬性之一。手性藥物在吸收、分布、代謝與排泄過程中，通過與體內大分子的不同立體結合，產生不同的藥理作用。因此，研究手性問題時應將對映體分開并區別對待。當前，手性拆分方法有很多。其中，膜分離法是一種較新的手性拆分方法，其具有產量高、能耗低、無污染、分離純度高、易于連續操作等優點，被認為是非常有潛力的大規模手性分離方法，也成為對映體拆分研究的熱點之一[1-2]。

通常，用于膜分離的手性選擇劑是被整合在膜內的，其能夠優先與一個異構體發生相互作用。目前，對映體拆分膜可分為液體膜和固體膜[3]。然而，由于液體膜在工業分離條件下的穩定性較差且壽命較短，因此，用于對映體拆分的主要是固體膜，包括復合材料膜[4]、配體交換膜[5]、氧化石墨烯膜[6]、聚合物膜[7]等。從歷史來看，纖維素由于其具有固有的手性性質和現成的可用性，是第一種用作色譜手性選擇劑的材料。20世紀60年代，人們首次采用反相技術將醋酸纖維素(CA)制備成膜，并將其廣泛用于環境工程、水軟化工程等領域中的反滲透、納濾、超濾、微濾等。盡管，CA膜自身即具有手性，然而其在手性拆分上的表現并不令人滿意，亟需采取方法改善CA的手性選擇性[8-9]。卡那霉素是一種氨基糖苷類抗生素，其具有多個手性中心及多個羥基和氨基官能團，是一種非常有潛力的手性選擇劑。本文以CA膜為基膜，用高碘酸鈉對其進行氧化，然后用卡那霉素(KM)以及氰基硼氫化鈉對其進行處理，最后得到手性改性CA膜。由于KM與L-氨基酸、D-氨基酸的結合能力不同，因而對映體具有不同的遷移速率，從而實現對映體拆分。實驗考察了酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)對映體在改性后的CA膜中的滲透情況，由此判斷所制備的手性改性CA膜是否具有手性選擇性。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

UV2550紫外可見分光光度計，島津儀器蘇州有限公司；Spectrum2000傅里葉紅外光譜儀，美國PerkinMer公司；BSA224S分析天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市易晨儀器制造有限公司；PHS-3C臺式pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；PFC磁力攪拌器，上海山岳科學儀器有限公司；GZY-P20-W超純水機，湖南科爾頓水務有限公司。

AC膜(孔徑0.45 μm，直徑47 mm)，德國Ahlstrom公司；L-Trp、D-Trp、L-Tyr、D-Tyr、L-Phe和D-Phe(純度98%或99%)，上海源葉生物科技有限公司；氰基硼氫化鈉、偏高碘酸鈉，Alfa Aesar中國化學有限公司；其他試劑均為分析純，用水為超純水。

1.2 KM改性CA膜的制備

將CA膜置于水中浸泡1 h，然后置于50 mL 0.75 M的偏高碘酸鈉中進行氧化，在30 ℃恒溫條件下磁力攪拌2 h。膜取出后，先用去離子水漂洗三遍，再用磷酸鹽緩沖溶液(PBS，5 mM，pH 5.7)漂洗三遍。用上述PBS配制50 mL 2 mM KM溶液，將膜浸泡于該溶液當中，磁力攪拌2 h，KM上的氨基會與CA羥基氧化后的羰基發生反應生成亞胺離子中間體。最后，用上述PBS配制50 mL 10 mM的氰基硼氫化鈉溶液，將膜浸泡其中磁力攪拌2 h，使亞胺離子中間體加氫生成仲胺。

1.3 氨基酸對映體的滲析實驗

實驗采用自制的H型電解池作為滲析實驗裝置。用50 mL 50 mM的PBS配制1 mM的氨基酸溶液，加到進樣池中，并在透過池中直接加入50 mL 50 mM的PBS，PBS的pH依據氨基酸的等電點進行設置。滲析實驗在室溫下進行，每隔1 h對進樣池中樣品溶液的吸光度進行檢測。將對映體的濃度隨滲析時間的變化定義為對映體分離度α：

α=KD/KL

(1)

其中KD和KL分別為D型和L型氨基酸的過膜速率。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 偏高碘酸鈉濃度的優化

使用濃度分別為0.1 M、0.25 M、0.5 M、0.75 M、1 M的偏高碘酸鈉進行氧化實驗。實驗發現，偏高碘酸鈉濃度越大，醛基含量就愈高。因為氧化劑濃度越大，與CA接觸的幾率就越大，對氧化反應和醛基形成越有利。但是偏高碘酸鈉的溶解度有限，濃度超過0.75 M后，其很難溶解，故選擇0.75 M作為偏高碘酸鈉的濃度。

2.1.2 偏高碘酸鈉氧化時間優化

將氧化時間設為1 h、1.25 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h進行對比實驗。結果發現，起初氧化時間越長，氧化效果越好，但是當氧化時間大于2 h后，氧化效果并沒有很大變化。因此，最佳氧化時間應為2 h。

2.1.3 卡那霉素濃度的優化

通過胺甲基化反應，將KM接在氧化后的CA上。采用濃度為1 mM、2 mM、5 mM的KM進行優化實驗。實驗結果表明，當KM濃度為2 mM時，酪氨酸和色氨酸的分離度最高，因此，最佳的手性選擇劑濃度為2 mM。

2.1.4 氰基硼氫化鈉濃度的優化

將羰基跟氨基反應生成的亞胺離子中間體用氰基硼氫化鈉還原成仲胺。該反應需在弱酸條件下進行，因為弱酸條件一方面可以使羰基質子化從而增強親電性，另一方面可以避免胺過度質子化造成的親核性下降。將氰基硼氫化鈉的濃度設為5 mM、10 mM、15 mM進行對比實驗。結果表明，當氰基硼氫化鈉的濃度為10 mM時，氨基酸的分離度最高，所以氰基硼氫化鈉的最佳濃度為10 mM。

2.1.5 滲析實驗pH值的優化

由于氨基酸分子中含有羧基和氨基，所以在不相同的pH值下，氨基酸所呈現的狀態不相同，因而遷移速率也不相同。三種氨基酸的等電點如下：色氨酸5.89，酪氨酸5.66，苯丙氨酸5.48。課題組以前的結果表明[10]，氨基酸的等電點即為滲析實驗的最佳pH值。主要原因可能是，等電點下，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，對手性改性CA膜識別對映體產生的影響最小。

2.1.6 滲析實驗PBS濃度的優化

PBS作為緩沖溶液，其濃度對手性改性CA膜與氨基酸的結合能力有一定的影響。采用濃度為25 mM、50 mM、75 mM的PBS進行優化實驗，實驗結果表明，PBS濃度為50 mM時，酪氨酸和色氨酸的分離度最高。所以，最佳的PBS濃度應為50 mM。

2.2 膜的表征

KM改性CA膜與空白CA膜的紅外光譜如圖1所示。由圖1A可知：KM改性CA膜在2600 cm-1處有最大吸收峰，此處應為NH伸縮振動峰，在1800 cm-1處有羥基的伸縮振動峰；由圖3B可知：空白CA膜在750 cm-1左右有最大吸收峰，此處應為C-O-C伸縮振動峰，而在1600處有C=O伸縮振動峰，在1900 cm-1處有羥基振動峰。由于CA是纖維素醋酸酯，因此其含有-OH、C=O、C-O-C等基團，而經KM改性的CA膜，NH2反應后變成NH，并且含有羥基。因此，可以判斷KM成功地接在了CA膜上。然而，由于我們所測的是成膜后的膜的紅外光譜，所以和用粉末測的紅外數據之間有偏差，峰的位置整體發生了頻率位移。

2.3 氨基酸對映體的滲析實驗

按照1.3部分進行滲析實驗，各氨基酸對映體在空白CA膜和KM改性CA膜中的滲透情況如圖2和圖3所示。圖中擬合直線的斜率即為氨基酸的過膜速率，按照公式(1)計算對映體分離度。從圖2、3可以看出，無論是在空白CA膜還是KM改性CA膜中，Phe對映體的過膜濃度都表現得極為不穩定，這可能是由于所測濃度接近線性范圍下限，測量結果不準確造成的。對于Trp對映體，其D型和L型對映體在空白CA膜和KM改性CA膜中的滲透情況基本一致，改性前后分離度都接近1，即KM改性CA膜對其沒有手性選擇性。而對于Tyr對映體，其在空白CA膜中的分離度接近1，而在KM改性CA膜中的分離度達到了1.65。這表明，KM改性CA膜對Tyr對映體具有手性選擇性。

2.4 手性膜的重復利用性

對KM改性CA膜的重復利用性進行考察，將其用于Tyr對映體的滲透實驗，連續使用五次的分離度分別為1.58、1.63、1.79、1.48、1.78，五組數據的相對平均偏差為13%。由此可見，該膜的重復性尚可。

2.5 手性選擇機理

Tyr分子結構中除了擁有氨基和羧基，其在苯環上還有一個羥基，可以和膜形成三點相互作用，因而其與膜的結合力最強。這一點從Tyr的過膜速率也可以得到驗證。無論是空白膜還是KM改性膜，Tyr對映體的過膜速率均低于Trp對映體。另外，由于Tyr的分子結構比Trp的分子結構小，其對映體與膜之間的相互作用差別也相對較大。因此，KM改性CA膜對Tyr對映體具有手性選擇性。而對于Phe對映體，由于檢測范圍的問題，實驗上沒有得到可靠數據。盡管如此，我們推斷Phe對映體的分離度不會高于Tyr，因為Phe比Tyr少了一個羥基，其與膜只能形成兩點相互作用。

圖1 KM改性CA膜(A)和空白CA膜(B)的紅外光譜圖

圖2 Trp(A)、Tyr(B)、Phe(C)對映體在空白CA膜中的滲透情況

圖3 Trp(A)、Tyr(B)、Phe(C)對映體在KA改性CA膜中的滲透情況

3 結 論

本文對KM改性CA膜拆分氨基酸對映體進行了探究。對影響手性拆分效果的實驗條件進行了優化，如氧化劑偏高碘酸鈉濃度和氧化時間，KM和氰基硼氫化鈉的濃度，以及PBS的濃度和pH。在優化條件下，將KM改性CA膜用于Phe、Trp和Tyr對映體的滲析實驗。實驗結果表明，KM改性CA膜對Tyr對映體的拆分效果最好。