鏈格孢霉菌毒素的研究進展*

郭詩曼，馮 啟

(浙江外國語學院科學技術學院，浙江 杭州 310023)

鏈格孢霉菌(Alternariatoxins) 是一種絲狀真菌，在蔬菜、水果及谷物中的病原體和腐生菌中多有發現[1]。經研究發現，這些代謝產物具有致突變、致癌、致畸、致死、細胞毒性、基因毒性、胚胎毒性、急性毒性等毒性[2]，比如研究人員發現了某些代謝物與人類食道癌密切相關[3]。農作物被該菌侵染之后會出現小麥黑斑病、柑橘黑斑病等常見的病害，造成糧食減產或水果腐爛。鏈格孢霉菌的污染地域也十分廣闊，遍及歐洲、美洲及亞洲。歐洲食品安全局已經對鏈格孢霉毒素進行了風險評估，認為具有遺傳毒性的交鏈孢酚與交鏈孢酚單甲醚應該引起人們的重視[4]。而此前，該菌都未引起學者的關注，考慮其污染范圍、污染物種及毒理性質，目前已經有越來越多的科學家著手研究鏈格孢霉毒素。但是目前全世界范圍內都沒有定制鏈格孢霉菌毒素的限量標準。本文詳細綜述了鏈格孢霉菌毒素的毒理性質與污染現狀，概述了檢測方法，旨在推動我國盡快建立關于鏈格孢霉菌毒素的標準與規范。

1 簡介與毒理性質

鏈格孢霉菌是一種廣泛分布于泥土的真菌，能通過田間侵染、貯存接觸等途徑污染農作物。值得注意的是，由于鏈格孢霉菌能在低溫環境下完成生長繁殖，所以鏈格孢霉菌還是導致瓜果、蔬菜以及一些冷藏食品腐敗變質主要真菌。鏈格孢霉菌能產生許多次級代謝產物，其中有一些已被證實具有明顯毒性[5]，但是只有很少一部分毒素的化學結構被表征，這些毒素根據其化學結構可分為五類(見表1和圖1)。其中，AOH、AME、TeA、TEN是目前科學家們關注最多的四種毒素。

表1 鏈格孢霉毒素分類

1.1 交鏈孢酚(AOH)

AOH的外觀為無色針狀晶體，分子式為C14H10O5，摩爾質量為258.23，熔點350 ℃，密度1.56 g/cm3，與氯化物混合反應后會呈現紫色，經紫外線照射后會發出藍色熒光[6]。目前發現AOH 具有致突變性、致癌性、基因毒性、遺傳毒性、細胞毒性、胚胎毒性，但AOH對實驗所用動物的急性毒性較低。

Celia等[7]評估了AOH引發毒性的途徑，結果顯示經AOH處理24 h和48 h后的細胞出現凋亡或壞死，線粒體膜電位(Δψm)也出現相應變化，從而產生細胞毒性。Fernández等[8]也評估了AOH在人結腸腺癌(Caco-2)細胞中的細胞毒性，結果表明，AOH在最高測試濃度下對Caco-2細胞具有細胞毒性作用。Liu等[9]研究發現AOH可引起細胞的致突變和轉化，還可誘導胎兒食管鱗狀細胞癌的發生。此外，有研究顯示AOH與我國某些地區食管癌高發密切相關[4]，且AOH的致癌機理與AOH的活性、癌基因的激活以及抑癌基因的變異密切相關。

Fliszár-Nyúl等[10]對AOH與牛、豬和大鼠蛋白的結合親和力進行了測試，結果表明AOH與血清蛋白有很強的相互作用，提示了這些相互作用在體內的潛在重要性。還有研究發現，AOH通過抑制DNA拓撲異構酶的活性來誘導細胞死亡。拓撲異構酶與DNA的超螺旋調節聯系在一起，并參與細胞的復制、轉錄和修復等，AOH由此引起單鏈 DNA 和雙鏈 DNA 的斷裂[11]。Solhaug等[12]發現細胞應激通常與自噬有關，因此采用RAW264.7巨噬細胞模型來驗證AOH誘導自噬的假說。透射電鏡分析表明，AOH處理的細胞不僅能清晰地顯示自噬相關的結構，如自噬體和自體溶酶體，而且還能清晰地顯示板層小體的出現。長期的AOH處理使細胞形態由圓形變為星形，β-半乳糖苷酶活性增加，這表明細胞最終進入衰老。因此，這些數據表明AOH是自噬和衰老的誘導劑。且這些作用可能與AOH誘導的DSB(通過對拓撲異構酶活性的影響)有關，導致p53和Sestrin2-AMPK-mTOR-S6K信號通路的激活。

圖1 四種鏈格孢霉毒素化學結構示意圖

此外，有研究發現AOH 對細胞天然免疫具有調節作用，Grover等[13]研究了AOH對人支氣管上皮細胞株(Beas-2B)和小鼠巨噬細胞株(RAW 264.7)天然免疫的調節作用，在研究中發現AOH能抑制脂多糖(LPS)誘導的天然免疫反應。用AOH處理Beas-2B細胞會引起形態學改變，包括分離的生長模式和伸長的手臂。AOH相關免疫抑制和形態學改變與這些真菌毒素在G2/M期引起細胞周期阻滯的能力有關。

1.2 交鏈孢酚單甲醚(AME)

AME的許多性質都與AOH相似，如外觀都是無色針狀晶體，經紫外線照射都可發出藍色熒光。AME的分子式是C15H12O5，摩爾質量為272.25，熔點 267 ℃。AME具有致畸性、致突變性、致癌性、胚胎毒性、誘變性。

有學者對AME的誘變性進行研究，如An等[14]研究發現，AME是大腸桿菌ND-160菌株的一種強誘變劑，而AME的致突變性表現出對特定基因組區域或DNA序列的選擇性。研究還發現，經高劑量AME喂養后的胎鼠會出現不同的癥狀，例如平均體重減輕和嚴重的器官衰竭。AME還可能引起細胞周期變化，例如動脈內出血，從而誘導癌細胞的產生。石智勇等[15]對食管癌高發區糧食中分離的AME在大鼠、小鼠體內的分布進行研究。實驗結果表明AME對前胃、食管下半部分有較高的親和力。

AME與其他毒素之間存在協同作用。Bensassi等[16]研究了交替醇二元混合物(AOH和AME)對人腸細胞株HCT 116細胞的作用。發現將HCT 116細胞暴露于低劑量的AOH或AME時，會產生細胞毒性，然而，當二者加在一起時，它們的毒性潛力就會大大增加。因此，該研究表明，AOH與AME的結合具有明顯的相加性。

1.3 細交鏈孢菌酮酸(TeA)

TeA是一種油狀、褐色物質，易溶于多種有機溶劑，能與許多物質發生螯合[17]。作為美國食品和藥物管理局(FDA)在有毒化學物質注冊中列出的唯一鏈格孢屬毒素，該毒素的特征是檢出率低，但產生毒素的能力非常強[2]。TeA具有急性及亞急性毒性、胚胎毒性、細胞毒性、致癌性以及致死性。

Yekeler等[18]研究了TeA對小鼠食管的可能毒性作用。小鼠口服TeA 10個月后，光鏡觀察發現這些動物出現以極性喪失、核多形性和色素亢進為特征的發育不良。經TeA處理的粘膜上皮細胞電鏡觀察顯示，部分細胞核固縮、顆粒化、染色質增多、核輪廓不規則、核質空泡化，在原子核中有明顯的多形性。綜上所述，Yekeler等認為TeA具有較高的毒性，表現為轉化異常。Gregory等[19]研究了AOH、AME、ALT、TeA對雞胚的影響。采用卵黃囊注射方法，對7日齡雞胚分別注射1000、500和1000 μg劑量的AOH、AME和ALT時，沒有出現致死率或致畸作用。而對雞胚注射548 μg劑量的TeA時，就有50%雞胚出現死亡，證實了TeA有致死性。除上文提到的毒性外，還有研究發現TeA可作為一些抑制劑。如Zhou等[20]發現TeA是防治棉花和煙田等重要雙子葉草和單子葉雜草的一種生物除草劑。

1.4 騰毒素(TEN)

TEN表現為結晶狀，在有機溶劑中極易溶解，熔點為172～175 ℃[21]。TEN是環四肽類毒素，具有植物毒性，與植物萎黃病密切相關，能通過降低植物細胞內ATP酶活性來抑制光合磷酸化。值得注意的是，TEN對哺乳動物的毒性試驗目前尚未見報道。

1.5 毒理學評估

2011年，歐洲食品安全局(EFSA)應歐盟的請求，審查食品和飼料中鏈格孢霉毒素的安全性。經研究，EFSA發現這些毒素一般存在于谷物和谷物制品、番茄和番茄制品、葵花籽和向日葵油、水果和水果制品以及啤酒和葡萄酒中。且鏈格孢霉毒素不僅能對許多作物造成植物疾病，其中一些毒素還能在體外和/或在大鼠體內產生遺傳毒性[4]。因此，EFSA采用了毒性關注閾值(TTC)方法來評估人類飲食中接觸這些毒素的相對關注程度。對于遺傳毒性毒素AOH和AME，目前人們慢性飲食接觸量已超過了相關的TTC值，需要引起人們的關注。而非遺傳毒性的TeA和TEN的飲食接觸估計值低于相關的TTC值，被認為不太可能成為人類健康的問題。同時，EFSA也對其攝入量發表了科學意見，TEN最大日攝入量閾值初步設為1500 ng/kg bw/d。我國國家風險評估中心也對鏈格孢霉毒素進行了評估，結果表明：隨膳食攝入的TeA對2～6歲兒童會存在健康威脅。然而，目前除巴伐利亞外，世界各地均無關于鏈格孢霉菌毒素的法規，我國只在出口水果蔬菜中鏈格孢菌毒素的測定中規定了其檢出限為10 μg/kg。考慮其毒性、污染范圍、污染地域，筆者認為我國應盡快建立關于鏈格孢霉毒素的標準與法規。

2 污染現狀

2.1 瓜果蔬菜

大多數果蔬營養豐富、含水量高，故極易于被鏈格孢霉毒素感染而得病。2000年以來，全球各地均有番茄、蘋果、藍莓、葡萄、柑橘等瓜果經報道被AOH與AME感染。而在上述提到的這些瓜果蔬菜中，最易受鏈格孢霉毒素感染的是番茄及其制品等，且TeA檢出率最高，其次是AOH和AME。

Noser等[22]研究了瑞士市場中的85種番茄產品，包括去皮和切碎的西紅柿，番茄湯和番茄醬以及干的和新鮮的西紅柿，發現有7份樣品中檢出了TeA。Sanzani等[23]對意大利南部的鮮、干番茄中交鏈孢毒素含量進行檢測，結果表明所有番茄樣品均不同程度地受到TeA的污染，其次是AME、TEN和AOH。除上述國家外，美國、巴西、阿根廷、瑞士、意大利等地的番茄中均有交鏈孢霉毒素檢出。

除番茄外，橘類也非常容易被鏈格孢霉菌感染。史文景等[24]采用UPLC-ESI-MS-MS法測定了100個柑橘樣品中的鏈格孢霉毒素，結果顯示有15%柑橘果皮樣品呈陽性，7%份全果樣品呈陽性，同時有3份果肉樣品被檢測出AME。

2.2 谷物及其制品

鏈格孢霉菌是普遍存在于各種谷物中的主要致病真菌。與果蔬相比，寄生于谷物中的鏈格孢菌株種類比較少，但其分布非常廣，遍及全球各地，德國和阿根廷等國家還曾爆發過由鏈格孢霉毒素引起的小麥黑胚病，導致小麥急劇減產，損失慘重，為此，歐洲長期監測鏈格孢霉菌對小麥的危害。

Jovana等[25]首次評價了鏈格孢霉菌侵染及其毒素對小麥品質的影響。結果表明，真菌污染顯著降低了貿易和工藝質量參數。接種鏈格孢霉菌后的小麥體積重、千粒重和濕面筋含量顯著降低，蛋白質含量顯著提高。AOH對體積重和千粒重影響最大(-0.847；-0.898)，與蛋白質含量(0.758)呈極顯著正相關。鏈格孢霉菌另外還破壞了面粉面筋結構，導致面團能量降低和烘焙質量下降。

Marina等[26]研究2001年至2010年勃蘭登堡州(德國)不同地區商業農場的1064個新收獲的冬小麥樣本中的鏈格孢霉毒素含量。采用二極管陣列和熒光檢測器相結合的高效液相色譜法(HPLC)分析了AOH、AME、ALT和TeA。最常見的真菌毒素是TeA，1064份樣品中有322份(30.3%)受TeA污染，86份(8.1%)被AOH污染，33份(3.1%)被AME污染，267份(2.6%)樣品中有7份(2.6%)受ALT污染。所有年份的最高毒素含量分別為4224 μg(TeA)kg-1，832 μg(AOH)kg-1，905 μg(AME)kg-1和197 μg(ALT)kg-1。幾種真菌毒素在小麥樣品中的共現率較低：只有3份樣品被全部4種毒素污染，14份被3種毒素污染，61份被2種毒素污染，273份被一種毒素污染。

2.3 油料作物

油料作物是一種種子中含有大量脂肪的作物，可用于提取食用油或用作工業和醫學原料。油料作物及其產品(例如食用油)非常容易受到霉菌毒素的污染。根據聯合國糧食及農業組織的估計，每年全球約25%的農產品被霉菌毒素污染，而油料作物無論是通過淋濾還是壓榨，其中的霉菌毒素都會隨之遷移到成品油中。Kralova等[27]2002-2003年共分析了在有機和/或常規耕作條件下種植的122個亞麻和84個豌豆種子樣本。結果顯示，有20份亞麻籽中檢出AME，其中2份和4份種還分別檢出ALT(交鏈孢烯)和AOH。Hickert等[28]對來自南非不同產地的不同品種的向日葵種子樣品(N=80)中鏈格孢屬真菌產生的15種毒素進行了分析。結果顯示，超過80%的樣品對一種或多種的鏈格孢霉毒素檢測結果呈陽性，并且其中TEN的檢出率最高，為73%，其次是TeA，檢出率為51%。

3 檢測方法

3.1 高效液相色譜法

HPLC常用于真菌毒素的實驗室仲裁檢測。Andersen等[29]建立了一種利用HPLC檢測和定量檢測蘋果致病性和產毒鏈格孢霉菌的實時PCR方法。實驗對8株鏈格孢霉菌進行了AM-毒素I基因及其產物的分析。結果表明，8株菌株均含有AM毒素基因，均能產生植物致病性觸須毒素。Pavón 等[30]采用HPLC對樣品中α-烯、互變酚和互變酚甲醚的發生情況進行了分析，以評價PCR法鑒定含有鏈格孢霉毒素的番茄樣品的能力。PCR檢測表明有鏈格孢霉菌的存在，90份商品樣品中有41份(45.6%) DNA，而在31份PCR陽性樣品中，HPLC檢測到至少1份鏈霉菌毒素。鏈格孢霉菌DNA的檢測與所分析的鏈格孢霉毒素的存在有很好的相關性。

3.2 高效液相色譜-串聯質譜法

高效液相色譜-串聯質譜法是目前鏈格孢霉毒素最常用的測定方法。Lilly等[31]建立了高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)方法，并應用穩定同位素稀釋法進行了分析。方法檢出限(LOD)為0.86 g/kg，定量限(LOQ)為2.89 g/kg。共對德國市場的26個番茄樣品和4個鈴椒樣品進行了分析。每個樣品中均檢出TeA，其濃度范圍為2330 μg/kg～3 g/kg。Sebastian等[32]建立了穩定同位素稀釋HPLC-MS/MS方法，對德國市場上的20種番茄產品進行了色譜分離，結果顯示所有產品均被TeA污染。Fraeyman等[33]建立了一種液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定豬和肉雞血漿中TeA含量的方法，并對其結果進行了驗證。相關系數、擬合優度系數、日內和日間精度均在驗收標準之內，鏈格孢霉毒素在豬和肉雞血漿中的定量限為5.0 ng/mL。

3.3 酶聯免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay)

除了上述傳統的檢測方法外，使用酶聯免疫吸附法快速靈敏地檢測交鏈孢菌毒素已成為近期研究的重點。Gross等[34]以天然污染的高粱粒和高粱為原料，以穩定的同位素稀釋LC-MS法(SIDA)為參考方法，對TeA的ELISA進行了比較分析。ELISA檢測高粱籽粒中LOD為30 μg/kg，高粱為220 μg/kg。SIDA在6～584 μg/kg(平均113 μg/kg)范圍內對茶葉的陽性率為100%(n=28)。雖然ELISA法比SIDA法靈敏度低得多，但它可以作為高粱和高粱為基礎的嬰兒食品的篩選方法。

4 結 語

鏈格孢霉菌是一種能廣泛侵染農作物、水果蔬菜的致病真菌，具有許多代謝產物，其中70多種被證實有明顯的毒性，如致畸性、致死性、致癌性、致突變性、細胞毒性、急性毒性、胚胎毒性等。科學家們主要關注的4種鏈格孢霉毒素為AOH、AME、TeA及TEN。這四種毒素常在谷物、水果、蔬菜、油料作物中被檢出，且有些檢出率極高，被污染的農作物遍布世界各地，能引起許多農作物病害。歐洲食品安全局已經對鏈格孢霉毒素進行了評估，結果表明隨著食品攝入的AOH與AME會對人體產生危害，并且對TEN的攝入量進行了評估，其最大日攝入量閾值初步設為1500 ng/kg bw/d。鑒于其毒性、污染范圍及對人體的潛在危害，中國與世界各國未來應加快速度建立鏈格孢霉毒素的限量標準，從而更好地為食品安全保駕護航。