1例引起突發(fā)性耳聾的豬鏈球菌的鑒定及分子流行病學(xué)分析*

鄭禮杰，李欣霖，張 文，陳建國(guó)，談忠鳴，許金鳳

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210009；4.鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心，江蘇鎮(zhèn)江 212000)

豬鏈球菌是一種兼性厭氧的革蘭染色陽(yáng)性細(xì)菌，寄生在豬、牛、驢等哺乳動(dòng)物、鳥類以及人類中，可導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎等疾病，是一種重要的人畜共患病原菌[1-3]。近二十年，由豬鏈球菌引起的人類感染顯著增加，被認(rèn)為是新出現(xiàn)的動(dòng)物傳染性疾病[4]。2002-2013年全球共有34個(gè)國(guó)家1 642例豬鏈球菌病的報(bào)道，90.2%發(fā)生在亞洲，8.5%發(fā)生在歐洲[5]，西方國(guó)家病例主要與職業(yè)接觸有關(guān)，而相當(dāng)一部分亞洲病例則與食用生豬制品有關(guān)[6]。根據(jù)莢膜多糖(CPS)抗原性的不同，豬鏈球菌被分為35種血清型(1-34型以及1/2型)[5]。目前，對(duì)豬致病性較強(qiáng)的常見血清型有1型、2型、1/2型、7型和9型等[7]。根據(jù)7個(gè)管家基因(aroA、cpn60、dpr、gki、muts、recA、thrA)核苷酸序列的不同，應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)將豬鏈球菌分為不同的序列類型(STs)[8]，目前已知的STs已有700多種。毒力相關(guān)基因纖溶酶釋放相關(guān)蛋白編碼基因(mrp)、溶血素基因(sly)、細(xì)胞外蛋白因子編碼基因(epf)、莢膜多糖編碼基因(cps)等在豬鏈球菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9-10]。本研究對(duì)分離自江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院(后簡(jiǎn)稱“本院”)的1例突發(fā)性耳聾患者血液和腦脊液中的豬鏈球菌進(jìn)行病原學(xué)鑒定和藥敏試驗(yàn)，并進(jìn)行分子流行病學(xué)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1病例介紹 患者，男，59歲，因“突發(fā)性耳聾”入院就診。入院時(shí)頭部脹痛、頭暈、聽力下降、言語(yǔ)不清、雙下肢乏力，伴有惡心、嘔吐。輔助檢查：白細(xì)胞5.7×109/L，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)5.3×109/L，中性粒細(xì)胞占比93%，血小板20×109/L ；C-反應(yīng)蛋白116.50 mmol/L。予以阿昔洛韋抗病毒、用潑尼龍琥珀酸鈉抑制免疫炎癥等治療。入院第2天，患者出現(xiàn)高熱，體溫最高39.1 ℃，伴有畏寒、寒戰(zhàn)，四肢及腹部紫癜，抽取外周血及腦脊液送微生物室培養(yǎng)，同時(shí)抗菌藥物改為頭孢呋辛鈉聯(lián)合環(huán)丙沙星。培養(yǎng)約5 h后，外周血和腦脊液培養(yǎng)瓶先后報(bào)陽(yáng)，涂片提示革蘭陽(yáng)性鏈球菌，經(jīng)VITEK-2 Compact微生物系統(tǒng)鑒定為豬鏈球菌，提示該患者為豬鏈球菌感染。轉(zhuǎn)感染科治療，據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整抗菌藥物，予以美羅培南抗感染治療。患者出現(xiàn)聽力障礙，請(qǐng)五官科會(huì)診確定雙耳全聾，予以鼓室內(nèi)注射用潑尼龍琥珀酸鈉治療，效果欠佳。入院第19天，患者體溫正常，頭痛緩解、乏力減輕，感染治愈，但聽力無(wú)法恢復(fù)。發(fā)病第46天，行右側(cè)電子耳蝸植入術(shù)，患者恢復(fù)出院。

1.2主要儀器與試劑 Bact/ALERT 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀(法國(guó)生物梅里埃)，VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃)，PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf 公司)，電泳儀(Bio-Rad公司)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(GENE公司)。PCR試劑盒(大連寶生物公司)，細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京卓誠(chéng)惠生生物科技股份有限公司)，豬鏈球菌核酸檢測(cè)試劑盒及豬鏈球菌分型核酸檢測(cè)試劑盒(江蘇碩世生物科技有限公司)，16S rRNA基因引物、管家基因引物及毒力基因引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.3細(xì)菌儀器表型鑒定及藥敏試驗(yàn) 采集患者雙臂靜脈外周血各8～10 mL及腦脊液2 mL分別注入血培養(yǎng)瓶，置Bact/ALERT 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀中孵育。培養(yǎng)5 h后，培養(yǎng)瓶陸續(xù)報(bào)陽(yáng)，抽取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)容物，涂片革蘭染色，同時(shí)接種哥倫比亞血平板和麥康凱平板。根據(jù)細(xì)菌革蘭染色結(jié)果選擇合適的鑒定和藥敏卡，放置VITEK-2 Compact微生物系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。抗菌藥物敏感性試驗(yàn)判讀按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2018年版要求進(jìn)行，質(zhì)控菌株為無(wú)乳鏈球菌ATCC 13813和金黃色葡萄球菌ATCC 29213。

1.4豬鏈球菌靶基因檢測(cè) 細(xì)菌DNA提取：按照試劑盒說(shuō)明書提取目標(biāo)DNA，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒄瘴墨I(xiàn)[11-12]合成下列引物：16S rRNA基因前向引物：CCTACGGGNGGCWGCAG，反向引物：GACTACHVGGGTATCTAATCC，豬鏈球菌管家基因aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA(表1)，豬鏈球菌毒力基因cps、mrp、epf、sly(表2)。16S rRNA反應(yīng)體系20 μL，包含上下游引物各1 μL、模板1 μL、預(yù)混液17 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min， 94 ℃變性30 s、48 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。管家基因和毒力基因反應(yīng)體系各50 μl，包含上下游引物各1 μL、模板1 μL、預(yù)混液47 μL，反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s、61 ℃退火30 s (毒力基因60 ℃)、72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測(cè)序。

表1 豬鏈球菌MLST分型引物列表

1.5MLST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì) 將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后得到的序列與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，得到各管家基因的等位基因數(shù)。將得到的7個(gè)等位基因數(shù)上傳至數(shù)據(jù)庫(kù)查詢具體的ST型別，并將ST型別結(jié)果上傳至數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.6豬鏈球菌核酸和豬鏈球菌分型核酸檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書操作，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

表2 毒力基因特異引物PCR引物序列及退火溫度

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)和染色鏡檢 報(bào)陽(yáng)血標(biāo)本接種后，經(jīng)培養(yǎng)箱35 ℃孵育24 h，哥倫比亞血平板上長(zhǎng)出灰白透明色，針尖樣露珠大小，光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊有α溶血環(huán)的菌落(圖1)。經(jīng)革蘭染色，鏡下觀察為成雙排列或短鏈狀的革蘭陽(yáng)性球菌，呈散在、成對(duì)或短鏈狀分布(圖2)。

圖1 菌落生長(zhǎng)形態(tài)

圖2 菌株革蘭染色鏡檢

2.2鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果 VITEK-2 Compact系統(tǒng)鑒定為豬鏈球菌，鑒定率僅為50%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果：氨芐西林、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、青霉素、萬(wàn)古霉素、美羅培南均敏感。

2.3豬鏈球菌16S rRNA基因檢測(cè)結(jié)果 16S rRNA基因檢測(cè)得到一條約450 bp的條帶(圖3)，測(cè)序后得到的序列同美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，顯示與豬鏈球菌(登錄號(hào)：MH699317.1)的同源性為98.35%。

2.4豬鏈球菌MLST分型結(jié)果 7個(gè)管家基因電泳均得到清晰條帶(圖4)，約500 bp，與目標(biāo)條帶一致。aroA、cpn60、dpr、gki、muts、recA、thrA等位基因數(shù)量分別為1、1、1、1、1、1、3，與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)此次分離到的菌株為ST7型。

注：M為DNA Marker；1為16S rRNA。

注：M為DNA Marker；1為dpr；2為thrA；3為cpn60；4為recA；5為gki；6為aroA；7為mutS。

2.5豬鏈球菌核酸和分型核酸檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定此菌株為豬鏈球菌血清型2型(圖5、圖6)。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果為豬鏈球菌

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果為豬鏈球菌2型

2.6毒力基因檢測(cè)結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，本菌株表現(xiàn)為sly+/cps+/epf+(圖7)。

注：M為DNA Marker；1為mrp；2為sly；3為cps；4為epf；5為陰性對(duì)照。

3 討 論

大多數(shù)豬鏈球菌在羊或牛血瓊脂平板上呈α溶血，在馬血平板上呈β溶血[6]，鏡下呈卵圓形或球形，大小1.0～1.5 μm，單個(gè)、成對(duì)或鏈狀出現(xiàn)。臨床可以通過(guò)細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)或者分子生物學(xué)的方法對(duì)豬鏈球菌進(jìn)行鑒定，并需注意與肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、D群鏈球菌、腸球菌等鑒別。本研究中，菌落形態(tài)和鏡下特征與豬鏈球菌相符，但機(jī)器鑒定率僅為50%，這或許與細(xì)菌生化反應(yīng)不充分或豬鏈球菌培養(yǎng)條件有關(guān)，后續(xù)16S rRNA結(jié)果與豬鏈球菌同源性為98.35%，確定該病原菌為豬鏈球菌。與VITEK-2 Compact的傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法相比，16S rRNA基因序列分析方法具有鑒定準(zhǔn)確率高、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[13]，適用于臨床重要且難以鑒定的菌株。

豬鏈球菌在豬中有較高的流行性，在人類不常見，但一旦感染病情往往很嚴(yán)重。人群普遍易感，主要通過(guò)開放性傷口傳播，如人皮膚或黏膜的創(chuàng)口接觸病死豬的血液和(或)體液、加工處理病豬肉引起發(fā)病，或因吃了未煮熟的病豬肉或內(nèi)臟而感染。人感染豬鏈球菌后主要的臨床綜合征為腦膜炎[5]，其次是敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和眼內(nèi)炎[14-15]，嚴(yán)重病例發(fā)展為不可逆的中毒性休克，病死率可達(dá)62.7%[6]。腦膜炎最常見的后遺癥是聽力喪失和(或)前庭功能障礙，報(bào)道的耳聾發(fā)生率在歐洲和亞洲分別為50%和73%[16]。本病例患者以“突發(fā)性耳聾”入院，入院第2天出現(xiàn)高熱、頭痛頭暈、惡心嘔吐并伴有肢體乏力，四肢及腹部紫癜，血液和腦脊液中分離出豬鏈球菌，符合腦膜炎合并敗血癥的臨床表現(xiàn)[6]，按照藥敏試驗(yàn)結(jié)果，患者經(jīng)積極治療，病情好轉(zhuǎn)，但仍致不可逆的雙耳全聾，不得不行電子耳蝸植入。該患者雖然沒有直接接觸病死豬，但在發(fā)病前3 d從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)得豬肺在家自行加工煮食，入院檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)患者手指指甲處有“倒刺”，推測(cè)豬鏈球菌從此傷口進(jìn)入人體并大量繁殖引起血源性感染和腦膜炎。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2002-2013年全球報(bào)道的1 642例人感染豬鏈球菌的病例中，最常見的血清型為2型，占74.7%，其次為14型；豬鏈球菌分型導(dǎo)致的中毒性休克稱為鏈球菌中毒性休克樣綜合征[5]。基礎(chǔ)研究也證實(shí)，豬鏈球菌2型可通過(guò)中性粒細(xì)胞逃避自然免疫監(jiān)視和消滅[17]。近年來(lái)我國(guó)報(bào)道的臨床病例也以豬鏈球菌2型和9型為主[18]，特別是江淮地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為2型[19]。在豬鏈球菌的分型中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在敏感性、特異性和重復(fù)性方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)[20]，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別進(jìn)行豬鏈球菌核酸、豬鏈球菌2型核酸檢測(cè)，確定為血清型2型，符合我國(guó)流行情況。

迄今為止，世界范圍內(nèi)報(bào)道的STs已經(jīng)有700多種。在歐洲，人和豬的感染病例中最常見的ST型為ST1，而亞洲和阿根廷主要為ST7[5]。2002-2013年，中國(guó)大陸豬感染病例中最常見的是豬鏈球菌2型ST7型[5]。2006-2016年，中國(guó)大陸地區(qū)散發(fā)的76例臨床病例分離出的豬鏈球菌中，主要流行的是ST1型和ST7型[21]。將本菌株管家基因信息上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果為ST7型。可見MLST技術(shù)的發(fā)展和普及使得不同STs的全球分布數(shù)據(jù)可以共享和比較，對(duì)本地區(qū)細(xì)菌流行病學(xué)也有更好的認(rèn)識(shí)和促進(jìn)作用。

豬鏈球菌的一種膽固醇依賴性細(xì)胞溶血素，被認(rèn)為是一種重要的毒力因子，具有細(xì)胞毒性、黏附、侵襲、胞內(nèi)存活等作用，在感染和宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[8]。cps可編碼莢膜多糖，在細(xì)菌侵襲、抵抗吞噬作用、腦膜炎的形成中發(fā)揮重要作用[10]。 隨著研究進(jìn)展，不同的莢膜多糖合成基因位點(diǎn)陸續(xù)被確認(rèn)[22]。sly、epf、mrp是目前常用的與STs相關(guān)的毒力標(biāo)記，主要跟豬鏈球菌2型菌株相關(guān)[5]。因此，本研究選取cps-2、sly、epf、mrp進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，結(jié)果除mrp外均為陽(yáng)性，表明此分離株為sly+/cps+/epf+強(qiáng)毒株。