不同Wnt信號分子對胚胎肝干細胞分化的影響研究

彭 利，馬文軍，崔潔潔，龔夢嘉，何 昀△

(重慶醫科大學附屬兒童醫院：1.醫學檢驗科；2.兒科研究所干細胞實驗室/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014)

肝功能衰竭是臨床最常見的病死率極高的肝病癥候群，嚴重威脅著人類的健康[1]。治療肝衰竭最有效的方法是肝移植，但由于供肝來源嚴重缺乏，手術難度高等，導致很大一部分患者得不到移植的機會。最新研究結果顯示，肝干細胞移植在急慢性肝功能衰竭的治療中有重要作用，但也存在著肝細胞在體外不能大量擴增且傳代后不能保持其原有細胞特性的問題。本課題組前期研究發現，肝干細胞具有長時間持續增生的能力，并且能在體外擴增獲得足夠的細胞數，但如何篩選和優化穩定的誘導體系、使肝干細胞定向分化在目前階段亟待解決。Wnt信號通路在細胞增殖、分化、生長、遷徙及氧化應激等多方面有復雜的信號級聯反應，調控肝臟發育和肝細胞分化[2-4]。迄今為止，對于肝細胞分化及其調控信號通路研究主要集中于β-catenin[5]，而對Wnt信號其他成員的研究相對較少。因此，本研究將集中探討Wnt家族成員對小鼠胚胎肝干細胞誘導分化的影響，篩選出最優通路和誘導因素，以期建立有效的肝干細胞定向分化體系，為臨床肝細胞移植治療肝衰竭提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑及材料 DMEM培養基、熒光素酶檢測試劑盒(NEB公司)、胎牛血清(Gibco公司)、清蛋白(ALB)抗體 (Santa Cruz)，實時熒光定量PCR試劑(Real-time PCR-SYBR?Green Ⅱ,寶生物工程公司)，糖原(PAS)染色試劑盒(SIGMA公司)，吲哚菁綠(ICG)試劑(SIGMA公司)。

1.2細胞與腺病毒感染 小鼠胚胎肝祖干細胞HP14-19由美國芝加哥大學腫瘤研究中心贈送，HEK293 細胞由本實驗室保存。HP14-19 在含10%胎牛血清的DMEM培養基37 ℃、5% CO2環境下培養。19種Ad-Wnt腺病毒和表達綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)(陰性對照)由美國芝加哥大學腫瘤研究中心饋贈，擴增腺病毒，當細胞感染率達到95%時，收集細胞并離心，得病毒液，-80 ℃保存。病毒感染細胞接種于24孔板上，24 h熒光顯微鏡檢測GFP表達。

1.3熒光素酶活性檢測 在24孔板上接種攜帶ALB-Gluc報告基因的HP14-19細胞，分別加入Ad-GFP和Ad-Wnt病毒液，在轉染后的第4、6、9天取上清液檢測熒光素酶活性。每組設置復孔，重復試驗3次，在酶標儀上選擇470 nm波長處讀數。

1.4實時熒光定量PCR檢測delta蛋白(DLK)、甲胎蛋白(AFP)等肝細胞特征性標志物mRNA水平 采用SYBR Green?Ⅰ染料法檢測各組細胞中 DLK、ALB、AFP、上皮特異性標志物細胞角蛋白18(CK18)等標志物 mRNA的表達量。分別收集各組細胞轉染9 d后總RNA，逆轉錄制備cDNA，實時熒光定量PCR：SRBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，模板cDNA 2 μL，上下引物各0.5 μL (10 μmol/L)，滅菌雙蒸水10 μL。PCR條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環。實驗重復3次。

1.5PAS染色實驗 HP14-19細胞加入Ad-GFP和Ad-Wnt3a病毒液。棄原培養基， 4%多聚甲醛固定15 min；后加入高碘酸溶液，室溫放置5 min；希夫試劑染色15 min；蘇木染色1 min；流水沖洗2 min，1%氨水10 s，流水沖洗。顯微鏡觀察。

1.6ICG攝取功能檢測實驗 HP14-19細胞分別加入Ad-GFP和Ad-Wnt3a病毒液，24孔板進行分化培養，加入配制好的ICG工作液于24孔板中(500 μL/孔)，在37 ℃中孵育1 h；顯微鏡下觀察細胞被誘導后的ICG攝取情況及細胞形態變化，拍照記錄。

1.7統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行處理。組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1免疫熒光染色結果 重組腺病毒Ad-GFP 和Ad-Wnt 1-16均能夠高效轉染 HP14-19 細胞，轉染率為60%～80%，其中GFP、Wnt3a、Wnt5b和Wnt11轉染結果見圖1 。

2.2熒光素酶報告基因活性檢測結果 19種Wnt腺病毒均能有效感染HP14-19細胞并表達相應的Wnt信號蛋白，隨著處理時間的延長，熒光素酶值的讀數逐漸升高，組間比較發現，Wnt2、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8a組較GFP陰性對照組明顯增高，其中Wnt3a的作用最明顯。 見圖2。

圖1 不同重組腺病毒對HP14-19細胞的感染情況(200×)

圖2 HP14-19轉染后第4、6、9天的ALB-GLuc活性

2.3mRNA表達情況比較 實時熒光定量PCR結果顯示，Ad-Wnt3a組肝干細胞標志DLK、AFP表達明顯下降；肝細胞特異性成熟標志ALB、CK18明顯上調(圖3)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 肝表面標志物DLK、AFP、ALB、CK18的mRNA表達情況

圖4 Ad-Wnt3a處理后HP14-19細胞PAS染色情況(100×)

2.4PAS染色實驗結果 HP14-19細胞PAS染色呈弱陽性，而Ad-Wnt3a處理后10 d，PAS染色可見70%～80%的細胞染色陽性，細胞質內存在大量紫紅色顆粒，細胞形態由多角形變為長梭形(圖4)。

2.5ICG攝取實驗結果 HP14-19細胞幾乎沒有ICG攝取能力，但經Ad-Wnt3a處理后，ICG攝取實驗可見大量綠色圓形或者多邊形陽性細胞(圖5)。

圖5 Ad-Wnt3a處理后HP14-19細胞ICG攝取情況(100×)

3 討 論

肝功能衰竭是臨床最常見的肝病癥候群，其病死率高，且在我國發病率呈上升趨勢。肝癌干細胞/前體細胞理論的提出是人們對肝臟疾病及其治療認識的新開始[6]。肝干細胞移植已經成功應用在動物模型及體外試驗中[7-8]，但其在細胞的再生、分化中的作用機制仍沒有明確。深入開展胚胎肝干細胞分化成熟機制的研究對認識肝臟發育、治療肝衰竭及肝干細胞的臨床應用有重要作用。

肝干細胞的分化是一個復雜、受多種因素影響的過程，多種因子和通路在促進分化的過程中起關鍵性調控作用。Wnt信號通路具有廣泛的生物學功能，在多種細胞增殖、分化、生長、遷徙及氧化應激等多方面有復雜的信號級聯反應，也在肝臟發育和肝細胞分化調控中具有重要作用。現階段已發現的Wnt蛋白有19種，分別參與了細胞生長分化、胚胎形成及腫瘤發生過程[9]。本研究中，通過ALB啟動子啟動的熒光素酶報告基因活性檢測篩選發現，Wnt2、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8a均能有效誘導肝細胞清蛋白表達，其中Wnt3a組ALB熒光素酶活性最高，提示Wnt3a可在成熟的肝細胞中高表達。HP14-19細胞自身PAS染色呈弱陽性，幾乎沒有ICG攝取能力，而經Ad-Wnt3a處理后，70%～80%的細胞PAS染色可見陽性，ICG攝取實驗可見大量綠色圓形或者多邊形陽性細胞，證實Wnt3a誘導的HP14-19細胞可表達成熟肝細胞表面標志物，由此得出結論，Wnt3a能夠誘導HP14-19向成熟肝細胞分化。Wnt3a是Wnt蛋白中一種重要的亞型，其分布廣泛，調節基因多樣，主要通過經典Wnt信號途徑發揮作用[10-11]。課題組前期研究發現，Frizzeld受體的同源分泌形式即分泌型同源卷曲蛋白家族(SFRPs)能夠與Wnt蛋白特異性結合，從而競爭性抑制Wnt蛋白與Frizzeld受體結合，阻止信號傳導[12]。Frzb是SFRP2的一個亞型，二者僅可在發育早期的肝組織中被檢測到，而成熟階段的肝細胞中幾乎檢測不到，即Frzb的表達下調，由此推測在肝細胞的分化過程中，Wnt3a高表達而其拮抗因子Frzb表達下調可能是肝臟發育和肝細胞分化所必需的。

研究發現Ad-Wnt3a 誘導HP 14-19 細胞高表達 Wnt3a后，PAS染色結果顯示細胞形態由多角形轉變為長梭形，同時實時熒光定量PCR結果顯示，HP14-19細胞中CK18的表達量明顯下調。有研究發現Wnt 信號途徑在小鼠肝前體細胞發生上皮-間質轉化 (EMT) 的過程中發揮重要作用[13]，但其具體的機制仍不明確。Wnt3a是Wnt經典途徑的代表蛋白[14-15]，此外，Wnt3a的高表達可以顯著升高EMT轉錄因子Snail的表達，而Snail作為EMT過程中的關鍵調控因子，可通過抑制間質標志物E-鈣黏附蛋白的表達使N-鈣黏附蛋白表達上調，從而削弱細胞間的連接，誘導EMT發生[16]。由此，研究者推斷Wnt3a在誘導HP14-19向成熟肝細胞分化的同時介導了EMT的發生。

4 結 論

Wnt信號通路在肝臟發育和肝細胞分化調控中具有重要作用。本研究利用不同Wnt蛋白基因的19種重組腺病毒，分別感染HP14-19細胞，通過熒光素酶報告系統篩選、肝細胞相關標志物的表達檢測，PAS實驗和ICG攝取實驗檢測肝細胞功能，Wnt3a蛋白是誘導HP14-19細胞成熟分化的重要蛋白，誘導分化后的細胞類似于成熟肝細胞，有較強的合成代謝功能。研究結果進一步說明了Wnt蛋白在肝干細胞分化調控中的作用，對進一步研究肝干細胞分化調控及肝移植應用有重要意義。