淋巴細胞亞群在新型冠狀病毒肺炎患者外周血中的表達及臨床意義*

李 泉，聶 珂△，喬正榮，代 濤，吳小蘭，李勇樸，柏 艷，左福林，周麗莉，朱小嵐,彭孝斌

(重慶市長壽區人民醫院：1.醫學檢驗科；2.感染科；3.呼吸重癥科；4.放射科，重慶 401220；5.重慶市長壽區疾病預防控制中心檢驗科，重慶 401220)

2019年12月，湖北省武漢市出現多起不明原因肺炎病例。目前，該肺炎被證實為一種新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染所致，且這種病毒存在人傳人現象[1-2]。該病毒屬于冠狀病毒科β屬，直徑60～140 nm，具有多形性，外有包膜，內含圓形或橢圓形顆粒，國際病毒分類學委員會將其命名為SARS-CoV-2[3]。國家衛生健康委員會目前已將SARS-CoV-2感染所致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)納入乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防、控制措施進行管理[4]。COVID-19的主要臨床表現以發熱、乏力、干咳等呼吸道感染癥狀為主，少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等，但有部分患者表現為隱匿發病，無明顯癥狀。重癥COVID-19患者在發病1周后可出現呼吸困難和(或)低氧血癥，并快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出、凝血功能障礙，最終導致患者死亡[5-6]。目前實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測SARS-CoV-2核酸陽性是COVID-19診斷的金標準[4]。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》[4]將發病早期白細胞總數正常或降低、淋巴細胞計數減少定為COVID-19的臨床表現之一，但目前關于COVID-19患者淋巴細胞亞群檢測的相關研究較少。本研究探討了外周血淋巴細胞亞群在COVID-19患者中的表達水平及臨床意義，以期為COVID-19的早期診斷和治療提供實驗室依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月18日至2月25于重慶市長壽區人民醫院住院治療的25例SARS-CoV-2核酸檢測陽性的患者為研究對象。其中21例確診為COVID-19，有發熱、咳嗽、乏力等臨床癥狀，SARS-CoV-2核酸檢測陽性的患者納入COVID-19組；4例無臨床癥狀，但SARS-CoV-2核酸檢測為陽性的患者納入無癥狀感染組。COVID-19組男10例，女11例；年齡為12～76歲，平均(51.84±6.24)歲。無癥狀感染組男2例，女2例；年齡為50～57歲，平均(53.00±0.51)歲。選取同期體檢的20例健康者為對照組,其中男9例，女11例；年齡為15～66歲，平均(43.05±5.48)歲。COVID-19診斷標準[4-5]：符合流行病學相關特征、符合疾病相關臨床表現，且咽拭子/痰液/纖維支氣管鏡灌洗液檢測SARS-CoV-2核酸為陽性。3組研究對象年齡、性別等基本資料比較，差異無統計學意義(P<0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 流式細胞儀(型號BriCyte E6)、CD3/CD16+56/CD45/CD19 檢測試劑(流式細胞法-FITC/PE/PerCP/APC)和CD3/CD8/CD45/CD4 檢測試劑(流式細胞法-FITC/PE/PerCP/APC)均由深圳邁瑞科技有限公司提供。

1.3檢測方法 研究對象均采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2) 抗凝靜脈血2 mL作為待測標本。取試管2支，1支試管中加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4 試劑，標記為“T”，另1 支試管中加入20 μL CD3/CD16+56/CD45/CD19 試劑，標記為“BNK”；然后分別向2 支試管中加入待測標本50 μL，混勻，室溫避光孵育15 min；再分別向2 支試管中加入450 μL 1×溶血素，混勻，室溫避光孵育5～10 min，上機檢測。總淋巴細胞計數參考區間：≥1 530/μL；自然殺傷細胞計數(NK#)參考區間：≥84/μL。

1.4觀察指標 分析COVID-19 組與無癥狀感染組患者總淋巴細胞計數(Lym#)及NK#水平；比較3組淋巴細胞亞群檢測結果，包括T淋巴細胞百分比(T%)、B淋巴細胞百分比(B%)、NK細胞百分比(NK%)、CD4+T淋巴細胞百分比(CD4+T%)、CD8+T淋巴細胞百分比(CD8+T%)、Lym#、T淋巴細胞計數(T#)、B淋巴細胞計數(B#)、CD4+T淋巴細胞計數(CD4+T#)、CD8+T淋巴細胞計數(CD8+T#)、NK#、CD4+T#與CD8+T#比值(CD4+T/CD8+T)。

1.5統計學處理 采用SPSS25.0 軟件進行數據分析，采用GraphPad Prism 6.0繪圖。偏態分布的計量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1COVID-19組患者Lym#及NK#水平 21例COVID-19患者中，18例(85.71%)患者的Lym#水平低于參考區間下限，3例(14.29%)患者的Lym#水平在正常參考區間內，見圖1。20例(95.24%)患者的NK#水平低于參考區間下限，且19例患者的NK#水平均低于50/μL，嚴重者僅為4/μL；僅1例患者的NK#水平在正常參考區間內，見圖2。

注：#1～#21分別代表21例確診為COVID-19且有臨床癥狀患者。

注：#1～#21分別代表21例確診為COVID-19且有臨床癥狀患者。

2.2無癥狀感染組患者Lym#及NK#水平 在4例無癥狀感染患者中，僅有1例患者的Lym#水平為1 353/μL，略低于參考區間下限，其他患者的Lym#、NK#水平均在參考區間內。見圖3～4。

2.33組淋巴細胞亞群檢測結果比較 3組間T%、B%、NK%、Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#、NK#水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。COVID-19組T%、B%水平高于對照組，NK%、Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#、NK#水平低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。COVID-19組NK#及NK%水平低于無癥狀感染組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

注：#22～#25分別代表4例核酸檢測陽性但無臨床癥狀的患者。

注：#22～#25分別代表4例核酸檢測陽性但無臨床癥狀的患者。

表1 3組淋巴細胞亞群結果分析[ M(P25，P75)]

3 討 論

淋巴細胞是人體的免疫細胞，在不同部位分化成熟，可分為T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞。淋巴細胞是在適應性免疫中起關鍵作用的細胞，是免疫系統的核心成分，使免疫系統具備識別和記憶抗原等能力，從而清除入侵機體的細菌、病毒等。

本文通過對21例COVID-19患者與20例健康體檢者的淋巴細胞亞群進行分析發現，85.71%的COVID-19患者表現為Lym#減少，95.24%的COVID-19患者表現為NK細胞減少，且與對照組比較，Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#水平均降低(P<0.05)。SARS-CoV-2可侵襲患者的淋巴結和脾等免疫器官，不斷增殖，從而感染更多的淋巴細胞和單核細胞，致其調亡，因此COVID-19患者表現為淋巴細胞減少。但有研究發現，在SARS-CoV-2感染后，短時間內機體為了對抗SARS-CoV-2感染，會產生特異性T淋巴細胞免疫反應，所以COVID-19患者感染早期可表現為T%和B%高于對照組[7]。

NK細胞具有細胞毒效應，無需抗原預先致敏就能殺傷靶細胞，其殺傷作用早于T淋巴細胞，因此在病毒感染后的早期免疫反應中發揮著重要作用。然而，為了適應NK細胞的選擇壓力，許多病毒已經具備了逃逸宿主NK細胞免疫反應的策略，大致包括上調NK細胞抑制信號[8]、下調NK細胞激活信號[9]、黏附分子[10]及分子模擬策略[11]。本研究發現，與對照組比較，COVID-19組患者NK%，NK#顯著降低(P<0.05)。COVID-19患者NK細胞減少的原因可能與以下相關：(1)患者本身免疫功能存在缺陷，NK細胞數量較少；(2)NK細胞在對抗SARS-CoV-2時發生自身消耗，機體的造血系統未能及時進行補充；(3)SARS-CoV-2感染機體后，侵犯機體免疫系統，病變累及淋巴結、扁桃體、脾和骨髓，出現多器官功能障礙，破壞NK細胞或抑制NK細胞的生成[9-10]。以上3點單獨或同時存在都可能造成人體在感染初期無法通過NK細胞來及時清除被病毒感染的細胞，最終導致COVID-19的發生。本研究4例無癥狀感染患者中，僅有1例患者的總淋巴細胞計數為1 353/μL，略低于正常參考值，其他患者的Lym#、NK#均在正常參考區間內。可能是由于SARS-CoV-2感染后，無癥狀感染者自身免疫功能強，產生大量NK細胞殺傷病毒，保護機體各器官不受損傷，所以未表現出臨床癥狀[11]。此外，本研究觀察到部分治療恢復期的COVID-19患者臨床癥狀與NK#有關，NK#恢復正常的患者其臨床癥狀恢復時間短于NK#異常者,但由于病例數較少，未進行相關統計分析，后續將進一步研究驗證。

4 結 論

COVID-19患者存在淋巴細胞亞群水平的異常，其中NK細胞下降明顯；COVID-19患者、無癥狀感染者與健康者淋巴細胞亞群水平存在差異，提示淋巴細胞亞群在COVID-19的診斷、病情評估中可能具有一定的臨床價值；此外，通過淋巴細胞亞群檢測還能了解患者的機體免疫情況，有利于判斷預后。