早期結(jié)直腸癌患者的靜脈血KRAS基因突變檢測*

李代昆，樊超強，吳茳鈴，余雪梅，李文明，薛建江△

(1.重慶醫(yī)科大學附屬大學城醫(yī)院檢驗科，重慶 401331； 2.陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院消化科，重慶 400037)

根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計、2015年中國癌癥統(tǒng)計和2018年全球癌癥在線數(shù)據(jù)庫的資料，2018年中國新增癌癥病例430萬，死亡病例290萬，36.4%死于消化道癌癥[1]；致癌危險因素中，環(huán)境和生活方式占40%，吸煙占24.5%，慢性感染占17%[2]。中國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均保持上升趨勢，2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：我國結(jié)直腸癌發(fā)病率、死亡率在全部惡性腫瘤中均位居第5位，其中新發(fā)病例37.6萬，死亡病例19.1萬。城市地區(qū)遠高于農(nóng)村，結(jié)腸癌的發(fā)病率明顯上升[2]。

直腸癌患者的鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)是否突變與腫瘤發(fā)病機制間具有較大的相關(guān)性，臨床研究表明結(jié)直腸癌患者的KRAS基因突變率為30%～40%；KRAS基因突變出現(xiàn)在結(jié)直腸癌的早期，患者的原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因突變情況基本一致[3]。將KRAS基因是否突變作為分子標志物對結(jié)直腸癌進行早期篩查，檢測結(jié)果對結(jié)直腸癌的防治具有重要意義。

PCR技術(shù)使基因突變檢測得到了較大的進展。本文采用基于擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)的熒光定量PCR技術(shù)檢測KRAS基因突變，該方法具有簡單、方便、快速和靈敏度較高等優(yōu)點，易于臨床開展。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院2018年6月至2019年3月進行腸鏡檢查的患者為研究對象，診斷標準為結(jié)直腸鏡檢查+病理學診斷。將病理學診斷為腺瘤伴灶性高級別癌變的24例患者納入試驗組，將病理學診斷未見異常的12例患者納入對照組。試驗組男14例，女10例；年齡38～72歲；乙狀結(jié)腸腺瘤伴灶性高級別癌變10例，升結(jié)腸腺瘤伴灶性高級別癌變6例，直腸腺瘤伴灶性高級別癌變8例；管狀結(jié)腸腺瘤14例，絨毛狀結(jié)腸腺瘤10例。對照組男6例，女6例；年齡42～68歲。試驗組納入標準為病理學診斷為腺瘤伴高級別癌變；排除標準為診斷為非結(jié)直腸癌的其他癌癥或診斷為腸炎或腸息肉等良性病變。試驗組與對照組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較[ n(%)]

1.2儀器與試劑

1.2.1試劑 核酸(循環(huán)DNA)提取試劑購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。Buffer CDL、Digest Solution、DNA Tracer、Buffer CDB、Buffer CDD、Buffer CW1(濃縮液)、Buffer CW2(濃縮液)、Buffer CDE、KRAS基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)均購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。KRAS19 PCR反應(yīng)條(引物、探針、鎂離子、dNTPs)，KRAS19混合酶(Taq DNA酶、UNG酶)，KRAS19陽性對照(質(zhì)粒DNA)，陰性對照(純化水)。KRAS19 PCR反應(yīng)條組成：KRAS19反應(yīng)液1-11，KRAS19外控反應(yīng)液。

1.2.2儀器 Strata gene Mx3000P實時熒光定量PCR儀購自美國安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1標本采集和保存 患者做腸鏡前，采集肘靜脈約15.0 mL(4支商品化的乙二胺四乙酸二鉀抗凝采血管)，緩慢輕柔顛倒采血管6～8次(防止靜脈血凝集或溶血)，3 000 r/min離心10 min，在生物安全柜內(nèi)收集上層血漿(約8.0 mL)，血漿未上機檢測前于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2標本DNA提取 按核酸提取試劑(型號：循環(huán) DNA)說明書進行操作，DNA分離完畢后，使用Nanodrop 2000測定DNA水平，DNA水平大于2 ng/μL，吸光度A260/A280為1.8～2.0。DNA提取后6 h內(nèi)未上機檢測應(yīng)保存于-20 ℃以下。

1.3.3PCR檢測流程 PCR反應(yīng)體系：DNA樣品65.8 μL，KRAS19混合酶4.2 μL，每反應(yīng)管加入混和好的PCR反應(yīng)物5 μL。KRAS19陽性對照(質(zhì)粒DNA)和陰性對照(純化水)按樣品DNA的檢測步驟操作，對PCR檢測流程進行質(zhì)量控制。后統(tǒng)一上機檢測，第1階段：95 ℃、5 min；第2階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)15次；第3階段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)31次。第3階段60 ℃時收集FAM和HEX(或VIC)信號。

1.3.4結(jié)果判斷 確定擴增曲線的拐點位置，得到Ct值，根據(jù)Ct值把檢測結(jié)果分為陰性(Ct值≥28)、弱陽性(26≤Ct值<28)和強陽性(Ct值<26)。

1.4統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

KRAS基因19種突變檢測結(jié)果,試驗組(24例)和對照組(12例)的血漿KRAS基因的突變率都為0.00%。試驗組患者的血漿KRAS基因19種突變檢測結(jié)果見表2。

表2 試驗組患者血漿標本的KRAS基因19種突變檢測結(jié)果

續(xù)表2 試驗組患者血漿標本的KRAS基因19種突變檢測結(jié)果

3 討 論

KRAS基因突變檢測的常用方法包括Sanger法測序、實時熒光定量PCR技術(shù)、ARMS技術(shù)、高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)等，檢測對象主要為癌變組織。Sanger法測序是檢測基因突變的金標準，丁莉等[4]對378例結(jié)直腸癌標本進行了檢測，KRAS基因突變率為34.7%；代云等[5]對265例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標本進行了檢測，KRAS基因突變率為32.1%；孫新超等[6]對210例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標本進行了檢測，KRAS基因突變率為43.8%。實時熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，凌云等[7]檢測了304例結(jié)直腸癌石蠟包埋標本，KRAS基因突變率為38.82%；梁躍等[8]檢測了58例結(jié)直腸癌組織標本，KRAS基因突變率為29.31%；贠田等[9]檢測了389例結(jié)直腸癌組織，KRAS突變率為42.4%。毛旭華等[10]采用HRM技術(shù)檢測了60例結(jié)直腸癌患者石蠟包埋組織標本，KRAS基因突變率為36.67%(Sanger法的突變率結(jié)果為33.33%)；MIRANDA等[11]采用HRM-定量PCR方法檢測了47例結(jié)直腸癌組織KRAS基因的2號外顯子突變情況，靈敏度和特異度分別為83.30% 和 96.6%，與第二代測序(NGS)法結(jié)果高度一致。

本文采用的方法基于ARMS，其原理為PCR引物的3′端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增。這一方法需先設(shè)計等位基因的特異性PCR擴增引物，只有引物3′堿基與模板嚴格配對才能出現(xiàn)PCR擴增帶，從而檢測出突變。羅妙玲等[12]檢測了177例結(jié)直腸癌手術(shù)切除或穿刺活檢標本，KRAS基因突變率為37.9%；祝繼原等[13]檢測了144例結(jié)直腸癌患者的手術(shù)石蠟標本，KRAS基因突變率為43.06%；張瑩等[14]檢測了60例結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除組織，KRAS基因突變率為38.3%。

本文檢測了血液標本中KRAS基因的突變情況，相關(guān)文獻較少。李學琴[15]采用酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測序技術(shù)檢測43例晚期非小細胞肺癌患者癌組織和外周血，癌組織KRAS突變率為9.30%，靜脈血KRAS突變率為6.95%。崔發(fā)強等[16]采用PCR法檢測96例原發(fā)性肝癌患者外周血，KRAS突變率為9.9%。伍潔[17]采用PCR-DNA直接測序法檢測129例原發(fā)結(jié)直腸癌組織標本和靜脈血標本，癌組織KRAS突變率為39.53%，靜脈血KRAS突變率為32.56%。BOTEZATU等[18]采用富集突變PCR-定量DNA熔解曲線分析(mePCR-qDMA)技術(shù)檢測20例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和血漿KRAS基因2號外顯子12和13位密碼子突變情況，KRAS基因突變率不一致(組織為60%、血漿為25%)。

ARMS技術(shù)尚未大規(guī)模應(yīng)用于血漿標本的檢測，本研究嘗試檢測血漿中KRAS基因突變的情況，但結(jié)果未檢測出KRAS基因突變，可能原因有：(1)檢測標本例數(shù)較少；(2)結(jié)直腸癌早期(包括癌前)血液中的KRAS突變基因含量較少；(3)檢測方法的靈敏度不足以檢測到微量KRAS基因突變。

4 結(jié) 論

靜脈血是結(jié)直腸癌早期篩查的理想標本，但需要提升檢測方法的靈敏度；采取不同方法的聯(lián)合達到揚長避短的目的，極大提高檢測的靈敏度。