慢性心力衰竭患者血清miR-21表達水平與炎癥因子、心功能分級和心肌重構的關系研究*

馬利輝,孫明霞，郭 娜

(邯鄲市中心醫院急診外一科，河北邯鄲 056009)

慢性心力衰竭(CHF)是由心肌疾病、血流動力學負荷過大等多種病因所致的心肌損傷性疾病，最終導致心室泵血和(或)充盈能力下降，是臨床老年患者死亡的主要病因之一[1]。明確CHF發生、發展的根本原因是疾病治療及最終預后優化的重要環節之一，但關于CHF發生的分子機制尚未完全明確。近年有研究發現微小RNA(miR)在心血管系統疾病的進展中發揮重要作用[2-3]，miR-21是其中的重要成員，已有研究發現其在妊娠期高血壓合并心力衰竭[4]、糖尿病心肌病[5]患者中以及心肌損傷大鼠[6]中均存在異常表達，并且與心肌損傷程度呈一定相關性，故推測miR-21可能與心力衰竭發生、發展過程存在一定關聯，但相關研究目前涉及不多。CHF患者存在不同程度的心功能異常，且存在著不同程度的炎性反應，本文以此為切入點探討CHF患者血清miR-21表達水平與炎癥因子、心功能狀態的相關性，旨在明確miR-21在CHF病情進展中發揮的作用，為后續CHF的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年7月本院門診收治的CHF患者90例作為CHF組，納入標準：(1)符合中華醫學會心血管病學分會、中華心血管病雜志編輯委員會制定的《慢性心力衰竭診斷治療指南》[7]中對CHF的定義；(2)首次確診并接受治療，既往無自主及外院治療史；(3)年齡>18歲且<80歲；(4)認知功能正常、配合相關檢查。排除標準：(1)既往有心臟手術史；(2)合并急性感染性心內膜炎等心臟疾病；(3)合并先天性心臟病；(4)合并嚴重肝、腎功能不全；(5)合并惡性腫瘤性疾病。另取同期在本院進行體檢的心功能正常的健康體檢者100例作為健康對照組，兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。見表1。入組人員均簽署知情同意書。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準。

表1 兩組研究對象一般資料比較

1.2血清miR-21表達水平檢測及二次分組 入組后(CHF組患者尚未接受藥物干預、健康對照組體檢當日)，留取兩組受試者的空腹靜脈血標本約5.0 mL，2 h內進行高速離心(5 000 r/min、15 min)并提取血清，采用實時熒光定量PCR檢測miR-21的表達量。使用RNA提取試劑盒抽提血液標本中的總RNA、采用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄合成cDNA并凍存于-20 ℃。miR-21引物序列為5′-AGCTGGATGCTGGCATGAT-3′，3′-CTGTAAGCTGAAGTCGAAG-5′；以U6基因作為內參基因，U6正向引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′ ，反向引物：5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′。使用miRNA實時熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測，反應條件：95 ℃ 20 s，60 ℃ 35 s；反應體系：cDNA 2 μL、miRNA qPCR premix 10 μL、特異性上游引物 0.4 μL、通用下游引物 0.4 μL、ddH2O 7.2 μL。擴增miRNA-21，根據2-ΔΔCt法計算miRNA-21的相對表達量，-ΔΔCtmiRNA-21=ΔCtmiRNA-21-ΔCtU6，每個樣品重復檢測3次。根據CHF組患者血清miR-21表達量的中位數，將90例CHF患者分為高miR-21組、低miR-21組各45例。

1.3心力衰竭指標比較 血清腦鈉肽(BNP)、腦鈉肽前體(NT-proBNP)檢測采用化學發光法，采用全自動生化分析(美國貝克曼庫爾特科技有限公司，型號：AU5800)對血清BNP、NT-proBNP水平進行檢測。

1.4血清炎癥因子水平檢測 另取各組研究對象的外周靜脈血標本并分離血清(具體方法同1.2)，采用酶聯免疫吸附檢測其中炎癥因子的水平，包括超敏-C反應蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6、IL-17。酶聯免疫吸附試劑盒購自上海西唐生物科技公司。

1.5超聲心臟指標檢測 入組后(CHF組患者尚未接受藥物干預、健康對照組體檢當日)，采用美國GE公司Vivid7全數字彩色多普勒超聲診斷儀檢測各組研究對象的心臟功能參數，包括左室射血分數(LVEF)、右室射血分數(RVEF)、每搏輸出量(SV)、心臟指數(CI)。同時采用美國紐約心臟病學會(NYHA)心功能分級評估研究對象的整體心功能狀態，包括Ⅰ～Ⅳ級，隨分級增加，患者心臟功能下降，其中Ⅲ～Ⅳ級為重度心功能下降。采用實時三維超聲心動圖檢測心肌重構參數，包括左心室后壁厚度(LVPW)、左心室質量指數(LVMI)、左室重構指數(LVRI)。

2 結 果

2.1血清miR-21表達量及血清BNP和NT-proBNP水平比較 CHF組血清中miR-21的表達量低于健康對照組，血清BNP和NT-proBNP水平明顯高于健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血清miR-21表達量及血清BNP和NT-proBNP水平比較

2.2炎癥因子水平比較 CHF組患者血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-17的水平高于健康對照組，其中低miR-21組患者血清中上述炎癥因子的水平高于高miR-21組患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3心功能情況及分級比較 CHF組患者的LVEF、RVEF、SV、CI低于健康對照組，其中低miR-21組患者上述超聲心功能參數低于高miR-21組患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。低miR-21組、高miR-21組的心功能分級情況差異均有統計學意義，CHF患者中低miR-21組的重度心功能下降患者比例高于高miR-21組(P<0.05)。見表4、5。

表3 各組研究對象血清中炎癥因子水平比較

表4 各組研究對象的心功能參數比較

表5 不同miR-21表達水平的CHF患者心功能分級情況比較[ n(%)]

2.4心肌重構參數比較 CHF組患者的超聲LVPW、LVMI、LVRI高于健康對照組，其中低miR-21組患者上述心肌重構參數高于高miR-21組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組研究對象的心肌重構參數比較

2.5相關性分析 Pearson相關分析發現，CHF患者血清miR-21表達水平與血清hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-17的水平呈負相關(r=-0.738,P=0.009；r=-0.657,P=0.013；r=-0.771,P=0.007；r=-0.598,P=0.017)；與心功能參數LVEF、RVEF、SV、CI呈正相關(r=0.698,P=0.013；r=0.714,P=0.011；r=0.883,P=0.003；r=0.606,P=0.016)，與心肌重構參數LVPW、LVMI、LVRI呈負相關(r=-0.677,P=0.013；r=-0.803,P=0.004；r=-0.657,P=0.014)；Spearman相關分析發現，CHF患者血清miR-21表達水平與心功能分級呈負相關(r=-0.587,P=0.016)。

3 討 論

miR-21具有促進血管新生的作用，特異表達于心肌細胞、血管內皮細胞、心臟成纖維細胞中，同時參與心肌細胞的生長及凋亡過程，已被發現在增生性血管疾病中表達上調[8]。近年有研究指出，在急性心血管疾患發生時，心肌細胞中的miR-21表達量可反應性上調并增加心肌細胞對缺血/再灌注損傷的耐受能力[9]。本研究發現，CHF患者血清中的miR-21表達水平低于健康對照組，這與miR-21表達下調后血管新生減弱、心肌損傷加劇等表現一致，這一現象出現的具體機制未明，推測在慢性循環衰竭過程中心肌組織反饋性上調miR-21表達的作用被抑制，最終導致miR-21表達下降、心肌及心功能損傷加劇。已有研究顯示，在CHF患者中miR-21表達水平明顯上調[10]，推測其原因可能是miR-21在CHF發病的不同階段所起到的作用有所不同。本研究中的CHF患者以早期為主，患者的心功能分級以Ⅰ級和Ⅱ級為主，推測在CHF發病早期miR-21可能起到抑制病情發展的作用，而在中晚期階段miR-21可能起到促進病情發展的作用。

炎性反應貫穿CHF整個病程，相關研究均證實多種炎癥因子在CHF患者冠狀動脈及心肌局部異常高表達，且具體表達水平與患者預后關系密切，可能參與后續心肌重構過程[11-12]。hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-17均是臨床研究較多的炎癥因子，hs-CRP可敏感地反映機體炎性反應程度并進一步激活TNF-α、IL-6等促炎因子，加速心功能惡化[13]。IL-17由Th17細胞分泌，具有強效促炎作用，可促進單核巨噬細胞募集并進一步分泌IL-6等炎癥因子[14]。本研究CHF組患者血清中上述炎癥因子的水平較健康對照組升高，且隨miR-21表達水平下降，CHF患者的炎性反應程度加劇，可能與miR-21表達降低對心肌細胞的保護力度下降、持續心肌損傷及體循環障礙等激發氧化應激反應并誘導大量炎癥因子產生等相關，以上結果也說明miR-21表達水平可反映CHF病情。有研究指出，心力衰竭發病過程受到Wnt/β-catenin和MAPK信號通路的調節，而miR-21參與Wnt/β-catenin和MAPK信號通路的活化調節，進而造成對心肌細胞的損傷[15]。研究表明，心肌纖維化過程中miR-21通過激活MAPK信號通路調節整個過程[16]，這也提示miR-21可能通過影響心肌纖維化，加重心肌損傷來影響CHF的發病過程。

CHF患者存在明顯泵血或舒張功能異常，在超聲心功能參數上可出現多個指標明顯異常，具體異常程度與疾病病情密切相關[17]。LVEF、RVEF水平分別反映左、右心功能，SV、CI反映整體心臟功能，本研究CHF組患者的心功能參數水平均較健康對照組低，其中低miR-21組患者上述心功能參數下降更為顯著，且低miR-21組患者心功能分級中重度心功能下降患者比例明顯更高，miR-21低表達可能加重心肌缺血損傷進而導致心功能持續惡化。相關性分析指出，CHF患者血清miR-21表達水平與上述心功能參數水平呈正相關、與心功能分級呈負相關，也說明miR-21表達水平可反映CHF病情。

持續存在的心肌缺血缺氧及體循環障礙等均可導致心肌重構發生，這是神經體液因子作用下心肌細胞的一種結構及功能障礙[18]。CHF患者存在明顯心肌后負荷增加，心肌重構一般以心肌肥厚為主要表現，且主要是心肌纖維增多而心肌數目并未發生改變，心肌細胞從本質上存在供能不足，長此以往可發展至心肌細胞不可逆性凋亡，這也是CHF發生發展的重要機制之一[19]。本研究CHF組患者尤其是低miR-21組患者存在LVPW、LVMI、LVRI升高，且相關性分析證實CHF患者血清miR-21表達水平與LVPW、LVMI、LVRI呈負相關，提示miR-21可能通過影響心肌重構從而影響CHF的病情發展。

4 結 論

本研究檢測了miR-21在CHF患者血清中的表達水平，發現CHF患者血清miR-21存在表達降低的情況，其可能通過影響炎性反應、心肌損傷和心室重構過程來影響CHF的發展，可考慮將其作為評估CHF患者病情發展的生物標志物。