基于多重PCR和第二代高通量測序技術(shù)快速檢測下呼吸道感染病原微生物方法的建立和應(yīng)用*

鄭凱文，黃曉園，陳渡波，張俊杰，王菊芳△，徐鴻緒▲

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,廣東廣州 510080)

下呼吸道感染是臨床最常見的感染性疾病之一，具有很高的病死率[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2018年公布的2016年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球前十位死亡原因中下呼吸道感染高居第四位，在傳染性疾病中位列第一，共導(dǎo)致約300萬人死亡[2]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法是檢測下呼吸道感染病原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但整個過程通常包括病原體培養(yǎng)、鑒定和抗菌藥物敏感性試驗，需要2～4 d甚至更長時間[3]。血清學(xué)方法也是下呼吸道病原體檢測的重要方法之一，但存在通量低，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等缺陷[4]。為了及時控制病情，臨床上常常采取經(jīng)驗性用藥，待得到培養(yǎng)結(jié)果及藥敏測試結(jié)果后再進(jìn)行調(diào)整。但這也容易導(dǎo)致抗菌藥物使用不當(dāng)，使病原微生物耐藥性出現(xiàn)及蔓延的概率增加[5]，導(dǎo)致下呼吸道感染的診斷和治療更為棘手，成為當(dāng)今全球共同面臨的重大衛(wèi)生挑戰(zhàn)[6-7]。因此，開發(fā)新的、更準(zhǔn)確及高通量的下呼吸道感染病原微生物檢測方法具有重要意義。

本研究采用生物信息學(xué)方法，針對肺炎克雷伯菌、化膿性鏈球菌、鮑曼不動桿菌等20種下呼吸道感染常見病原微生物設(shè)計40對特異性引物，通過PCR方法驗證引物的敏感性和特異性，建立多重PCR聯(lián)合第二代高通量測序技術(shù),即AC-Seq檢測體系。將該方法應(yīng)用于臨床肺泡灌洗液標(biāo)本的檢測并與臨床培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對比，旨在確立一種檢測下呼吸道感染常見病原微生物的快速、高通量方法，為下呼吸道感染病原體檢測技術(shù)的開發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)《下呼吸道感染實驗診斷規(guī)范》中下呼吸道感染病原譜[8]、中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)以及一些大型三甲醫(yī)院的統(tǒng)計數(shù)據(jù)[9-12]，本研究選擇了20種下呼吸道感染常見病原微生物作為研究對象，分別是肺炎克雷伯菌、化膿性鏈球菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌、黏質(zhì)沙雷菌、流感嗜血桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、屎腸球菌、糞腸球菌、白色念珠菌、近平滑假絲酵母菌。所有標(biāo)準(zhǔn)菌株均購自廣東省微生物菌種保藏中心。34份臨床肺泡灌洗液來自2018年11-12月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科的送檢標(biāo)本。依據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會2001年頒布的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》[13]對下呼吸道感染病例進(jìn)行診斷入組，排除臨床資料不完整的病例。

1.2儀器與試劑 PCR儀(Bio-Rad，美國)、DNA電泳儀(Bio-Rad，美國)、Qubit 4熒光計(ThermoFisher Scientific，美國)、凝膠成像儀(廣州博鷺騰，中國)、全自動研磨儀(上海凈信，中國)、自動化核酸提取儀(西安天隆，中國)、VITEK 2全自動微生物鑒定系統(tǒng)(BioMérieux，法國)、基因組核酸提取試劑盒(廣州美基，中國)、Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman Coulter，美國)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純等級。

1.3方法

1.3.1病原微生物培養(yǎng)與核酸提取 在無菌環(huán)境分別接種20種標(biāo)準(zhǔn)菌株于相應(yīng)培養(yǎng)平板上，在適宜溫度下培養(yǎng)12～24 h。挑取單個菌落，接種于5 mL液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。取1 mL菌液使用全自動研磨儀破碎細(xì)胞，用基因組核酸提取試劑盒及自動化核酸提取儀提取核酸，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物設(shè)計 本研究采用生物信息學(xué)方法篩選基因序列的保守區(qū)段，每個病原微生物設(shè)計兩對引物，共40對特異性引物，片段長度為90～110 bp，以便于銜接后續(xù)的第二代高通量測序。

1.3.3引物驗證 敏感性驗證：利用每對引物對目標(biāo)菌株基因組模板進(jìn)行單重PCR，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察條帶是否單一、明亮，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至第三方檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行DNA測序，驗證引物敏感性。特異性驗證：除去待驗證目標(biāo)菌株基因組，將其余19種目標(biāo)菌株基因組和人基因組等量混合，使用待驗證目標(biāo)菌株的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，以PCR產(chǎn)物有無非特異性條帶驗證引物特異性。根據(jù)模板混合物中包含的目標(biāo)，選擇兩對相應(yīng)引物在同樣條件下進(jìn)行PCR作為陽性對照，以證實PCR能否正常進(jìn)行。PCR擴(kuò)增：98 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行電泳檢測，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.4AC-Seq法檢測方程 (1)多重PCR體系建立。目標(biāo)序列擴(kuò)增：2×多重PCR Taq酶(預(yù)混和)20 μL，引物混合物(200 nmol/L)4 μL，DNA模板xμL(0.1≤x≤0.5)，ddH2O(16-x)μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 4 min，循環(huán)19 次；最后72 ℃延伸4 min；10 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化：使用Agencourt AMPure XP磁珠，按說明書操作。(2)測序文庫制備。引入測序接頭：2×多重PCR Taq酶(預(yù)混和)15 μL,接頭F (10 μmol/L) 1 μL，接頭R (10 μmol/L) 1 μL，DNA模板為上輪PCR純化產(chǎn)物，ddH2O 13 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)8次；最后72 ℃延伸10 min；10 ℃結(jié)束反應(yīng)。后重復(fù)PCR產(chǎn)物純化步驟。(3)文庫質(zhì)檢及測序：PCR產(chǎn)物文庫質(zhì)檢及測序由海普洛斯(深圳)生物科技有限公司完成。

1.3.5靈敏度檢測 以金黃色葡萄球菌ATCC 43300、肺炎鏈球菌ATCC 49619、鮑曼不動桿菌ATCC 19606、大腸桿菌ATCC 35150、白色念珠菌ATCC 10231為目標(biāo)，通過PCR方法從目標(biāo)菌基因組中獲取目標(biāo)擴(kuò)增片段。然后將擴(kuò)增片段依次梯度稀釋為106、105、104、103、102、101、100copy/μL，取5 μL模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，測序文庫制備流程見1.3.4)。每個梯度設(shè)置重復(fù)試驗3組。空白對照組模板均為無菌水。

1.3.6臨床標(biāo)本鑒定 將臨床標(biāo)本分成3份，一份均勻涂布在血平板上，培養(yǎng)12～24 h后挑取主要單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。病原微生物鑒定采用VITEK 2全自動微生物鑒定系統(tǒng)。一份用于AC-Seq法檢測，流程見1.3.4。另一份保存至-80 ℃冰箱備用。對兩種檢測方法結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)行單重PCR驗證，選擇的通用引物序列如下：細(xì)菌27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R 5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′；真菌ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′，ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理軟件采用Microsoft Excel 2016。統(tǒng)計分析軟件使采用SPSS22.0。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示。AC-Seq和臨床培養(yǎng)兩種檢測方法的結(jié)果比較采用配對χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1引物敏感性和特異性驗證 對引物進(jìn)行擴(kuò)增敏感性評估，2%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示40對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均獲得明亮、單一、清晰的DNA條帶，大小約為150 bp(含約50 bp測序接頭序列)。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用Sanger測序，BLAST比對確定為相應(yīng)菌株的核酸片段，表明40對引物均具有良好的擴(kuò)增敏感性，見圖1。對引物進(jìn)行擴(kuò)增特異性評估，2%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示40對引物均未獲得非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，且陽性對照條帶明亮清晰，表明40對引物均具有良好的擴(kuò)增特異性，見圖2。

注：M表示50 bp DNA Ladder；圖A中，1-1、1-2為肺炎克雷伯菌；2-1、2-2為化膿性鏈球菌；3-1、3-2為鮑曼不動桿菌；4-1、4-2為陰溝腸桿菌；5-1、5-2為銅綠假單胞菌；6-1、6-2為卡他莫拉菌；7-1、7-2為金黃色葡萄球菌；8-1、8-2為黏質(zhì)沙雷菌；9-1、9-2為流感嗜血桿菌；10-1、10-2為洋蔥伯克霍爾德菌；圖B中，11-1、11-2為嗜麥芽窄食單胞菌；12-1、12-2為產(chǎn)氣腸桿菌；13-1、13-2為大腸埃希菌；14-1、14-2為奇異變形桿菌；15-1、15-2為肺炎鏈球菌；16-1、16-2為嗜肺軍團(tuán)菌；17-1、17-2為屎腸球菌；18-1、18-2為糞腸球菌；19-1、19-2為白色念珠菌；20-1、20-2為近平滑假絲酵母菌。

2.2靈敏度檢測 靈敏度檢測結(jié)果顯示，模板分別為5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100、0拷貝，對應(yīng)檢出的平均reads依次為501 536.00、399 369.67、301 303.33、102 015.67、8 009.67、527.67、1.00、0.00。因此在40 μL擴(kuò)增體系中，本研究所建立方法的最低檢出模板量為5×100拷貝。見圖3。

2.3AC-Seq法檢測臨床標(biāo)本結(jié)果 AC-Seq法給出了34例臨床標(biāo)本的病原微生物分布及豐度。陽性標(biāo)本以深色方框表示，顏色越深表示標(biāo)本中該病原微生物核酸的檢出reads越多。白色表示未檢出。見圖4。

2.4臨床標(biāo)本兩種方法檢測結(jié)果比較 34例臨床標(biāo)本中AC-Seq共檢出13種病原微生物，其中檢出嗜麥芽窄食單胞菌16例，占比47.06%；鮑曼不動桿菌11例，占比32.35%；黏質(zhì)沙雷菌8例，占比23.53%；銅綠假單胞菌6例，占比17.65%；屎腸球菌5例，占比14.71%；大腸埃希菌2例，占比5.88%；肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、肺炎鏈球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、糞腸球菌各1例，均占比2.94%。

培養(yǎng)、鑒定方法共檢出8種病原微生物，其中檢出鮑曼不動桿菌7例，占比20.59%；嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌各2例，均占比5.88%；肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、白色念珠菌各1例，均占比2.94%。

AC-Seq法檢出陽性共計27例，總陽性率為79.41%；培養(yǎng)法檢出陽性共計11例，總陽性率為32.35%。兩種方法檢測結(jié)果一致的標(biāo)本共17例，總一致率為50%。經(jīng)配對χ2檢驗得出，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.195,P<0.05)。不一致結(jié)果經(jīng)第三方測序驗證后，統(tǒng)計得出AC-Seq檢測方法的靈敏度為100.00%，特異度為29.17%。

在檢測時間方面，傳統(tǒng)培養(yǎng)法需將樣品在平板培養(yǎng)24～48 h后，挑取主要單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)再通過VITEK 2全自動微生物鑒定系統(tǒng)確定病原微生物種類。AC-Seq法可在6 h完成32例標(biāo)本從核酸提取到多重PCR產(chǎn)物文庫構(gòu)建過程，18 h內(nèi)完成測序及結(jié)果分析，周轉(zhuǎn)時間不超過24 h。

注：M表示50 bp DNA Ladder；泳道0-1、0-2為陽性對照；1-1、1-2為肺炎克雷伯菌；2-1、2-2為化膿性鏈球菌；3-1、3-2為鮑曼不動桿菌；4-1、4-2為陰溝腸桿菌；5-1、5-2為銅綠假單胞菌；6-1、6-2為卡他莫拉菌；7-1、7-2為金黃色葡萄球菌；8-1、8-2為黏質(zhì)沙雷菌；9-1、9-2為流感嗜血桿菌；10-1、10-2為洋蔥伯克霍爾德菌；11-1、11-2為嗜麥芽窄食單胞菌；12-1、12-2為產(chǎn)氣腸桿菌；13-1、13-2為大腸埃希菌；14-1、14-2為奇異變形桿菌；15-1、15-2為肺炎鏈球菌；16-1、16-2為嗜肺軍團(tuán)菌；17-1、17-2為屎腸球菌；18-1、18-2為糞腸球菌；19-1、19-2為白色念珠菌；20-1、20-2為近平滑假絲酵母菌。

圖3 靈敏度檢測結(jié)果

圖4 AC-Seq法檢測臨床標(biāo)本病原微生物豐度熱圖

3 討 論

目前下呼吸道感染病原微生物的篩查主要依靠分離培養(yǎng)法及自動化的微生物鑒定系統(tǒng)，雖然具有操作簡便，成本低等優(yōu)點，但也存在通量低、耗時長、分離過程易受主觀因素影響等缺點[14-15]。其他檢測方法，如基于免疫熒光法的呼吸道九聯(lián)檢試劑盒，具有檢測速度快、靈敏度高等優(yōu)點，但主要針對的是呼吸道病毒、肺炎支原體和肺炎衣原體等病原體的檢測[16]；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增是一種基于有鏈置換活性的DNA聚合酶的等溫快速核酸擴(kuò)增方法[17]。應(yīng)用于下呼吸道病原體檢測，該方法有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)速度快，不需要特殊儀器等優(yōu)點[18]，但是該方法對引物的設(shè)計有特殊要求，因此在多重PCR及高通量檢測方面存在一定的缺陷。微流控技術(shù)具有小型化、集成化與自動化的優(yōu)勢，且試劑用量少、能耗低，污染少，但該方法技術(shù)成本高，不利于臨床大規(guī)模的病原微生物篩查及在中小醫(yī)院推廣[19]。

本研究通過自主設(shè)計特異性引物，聯(lián)合多重PCR與第二代高通量測序技術(shù)實現(xiàn)了20種下呼吸道感染常見病原微生物的高通量、快速檢測，可以至少覆蓋90%的臨床下呼吸道病原微生物，尤其適合多種病原微生物感染的檢測。本研究一方面通過多重PCR技術(shù)有效擴(kuò)增并富集病原微生物核酸，同時在純化環(huán)節(jié)去除人基因組及其他大片段非目標(biāo)核酸，彌補(bǔ)了宏基因組測序的缺陷[20]；另一方面，通過第二代高通量測序技術(shù)可以直接、客觀、高通量地鑒別感染病原微生物。

本研究建立的方法使用全自動研磨儀和全自動核酸提取儀直接從臨床標(biāo)本中提取核酸，在 1 h內(nèi)可處理32個標(biāo)本，提高了檢測效率，整個檢測過程耗時不超過24 h，可基本滿足臨床上大批量標(biāo)本病原微生物初篩的需求。此外通過高通量測序還可以獲得標(biāo)本中不同病原微生物的相對豐度信息，為臨床精準(zhǔn)治療提供參考。和培養(yǎng)鑒定法相比，檢測陽性率差異顯著及檢測特異性低的原因可能是多重PCR聯(lián)合第二代高通量測序技術(shù)大大提高了檢測的靈敏度；對于一些不一致的陽性結(jié)果，可能需要與臨床進(jìn)一步討論。在后續(xù)的研究中，會進(jìn)行更大規(guī)模的測試，以進(jìn)一步評估和優(yōu)化本方法。此外，還會將本方法應(yīng)用于耐藥基因、毒力基因的檢測，為臨床精準(zhǔn)用藥提供更全面的參考。

4 結(jié) 論

本研究采用生物信息學(xué)方法設(shè)計了40對特異性引物，通過PCR驗證了引物具有良好的敏感性和特異性。建立了可進(jìn)行第二代高通量測序技術(shù)的多重PCR擴(kuò)增體系。把建立的方法應(yīng)用于臨床肺泡灌洗液標(biāo)本的檢測并與臨床培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，本方法具有高靈敏度、高通量、短周期等優(yōu)勢。成功建立了一種對20種下呼吸道感染常見病原微生物檢測的快速、高通量方法。