長鏈非編碼RNA NEAT1、IL-6和TNF-α在結核感染中的表達水平及診斷價值研究*

陳 敏，余 韻，張 燕，唱 凱，皮 燕

(陸軍軍醫大學大坪醫院：1.檢驗科；2.神經內科，重慶 400042)

結核病作為當今世界致病性較強的傳染病之一，嚴重威脅人類健康。據統計，全球約 1/3 的人接觸過結核分枝桿菌(MTB)，每年新發感染人數約800萬，每年因結核病死亡的人數高達200萬[1]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，作為一種重要的轉錄后調節機制，參與調節包括細胞分化、生長、增殖和凋亡等幾乎所有的細胞活動過程，并在不同宿主的免疫效應中發揮著重要作用。作為細胞核小體旁斑(PS)結構的重要組成成分[2-3]，LncRNA NEAT1參與細胞周期的相關調控，但其在結核發病機制中的作用不清。有研究表示，LncRNA NEAT1可通過激活S期檢查點，穩定PS結構，避免DNA損失累積導致的細胞死亡[4-7]。本文聚焦于LncRNA NEAT1在結核病進程中可能的調控作用，擬開展以下研究：收集活動性結核與健康體檢者外周血，提取單個核細胞，利用實時熒光定量PCR的方法檢測LncRNA NEAT1及相關細胞因子的表達水平，并分析LncRNA NEAT1、白細胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α在活動性結核中的診斷效能。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集時間為2017年1-3月，研究對象分為健康對照組和活動性結核組。健康對照組為來自中國人民解放軍陸軍特色醫學中心的健康體檢者，共22例，入組研究對象無咳嗽、咳痰及發熱等其他全身癥狀，影像學檢查無異常，結核病相關實驗室檢查無任何異常，且血常規、紅細胞沉降率、肝、腎功能基本指標均正常。活動性結核組來自重慶市結核病治療中心根據《WS 288-2017肺結核診斷》標準收治的患者，共15例，其結核分枝桿菌培養陽性，涂片顯微鏡檢查陽性，γ-干擾素釋放試驗陽性，且有結核病相關臨床表現如咳嗽、咳痰、發熱、乏力等，影像學檢查發現病灶，臨床診斷為肺結核病。入組研究對象均采集外周血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，離心后30 min內分離單個核細胞保存備用。排除標準：免疫抑制劑使用者；患者合并其他感染性疾病；自身免疫性疾病、腫瘤、精神性疾病、嚴重外傷、貧血、腎臟或肝臟疾病、活動性肺結核合并人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、活動性肺結核合并Ⅱ型糖尿病者。

1.2儀器與試劑 RPMI-1640培養基購自天津灝洋華科生物有限公司；人淋巴細胞分離液購自美德太平洋生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、DMEM培養基購自GE Healthcare Life Science，trizol試劑購自美國Life Technologies公司；氯仿、異丙醇、75%乙醇溶液購自重慶茂業化學試劑有限公司；DNase/RNase-free deionized water購自北京天根生化科技有限公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Ki、FastStart Essential DNA Green Master購自上海羅氏診斷產品有限公司；引物購自英濰捷基(上海)貿易有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；ESAT-6抗原購自杭州啟泰公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；二氧化碳恒溫培養箱、NanoDrop2000超微量分光光度計購自美國Thermo 公司；液氮罐購自河南恒達儀器設備有限公司；流式細胞儀、小型低溫冷凍高速離心機購自美國BECKMAN公司；細胞培養瓶、六孔板、細胞凍存管購自美國康寧公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1外周血單個核細胞分離 按人外周血淋巴細胞分離液說明進行操作，收集單個核細胞沉淀，再加入1 mL trizol試劑，于-80 ℃凍存備用。

1.3.2外周血單個核細胞RNA提取 將凍存的外周血單個核細胞取出解凍并靜置5 min后，采用Trizol法提取RNA。使用 NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA水平及純度并記錄，置于-80 ℃保存。

1.3.3標本相關基因及細胞因子表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR，利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Ki試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為20 μL:FastStart Essential DNA Green Master(2×) 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，FastStart Essential DNA Green Master water，PCR Grade 7 μL。 PCR擴增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s共40個循環，于每次循環末收集綠色熒光。讀取熔解曲線確定擴增特異性，65 ℃起，每升溫0.5 ℃讀取一次熒光強度。根據實時熒光定量PCR結果，計算活動性結核組和健康對照組中每例標本的管家基因和目標基因LncRNA NEAT1、TNF-α、IL-6熔解曲線上的特征峰循環數，并計算ΔCt以及活動性結核組相對于健康對照組的ΔΔCt，根據相對定量2-ΔΔCt法計算LncRNA NEAT1、TNF-α、IL-6基因表達差異倍數。

LncRNA NEAT1 的轉錄本有2個亞型，即短片段NEAT1-1(約3.7 kb)和長片段NEAT1-2(約22 kb)，它們共享5′端轉錄起始點。人源LncRNA NEAT1引物見表1和圖1。

表1 實時熒光定量PCR引物(人源)

圖1 人源LncRNA NEAT1引物示意圖

2 結 果

2.1LncRNA NEAT1-1及NEAT1-2在健康對照組和活動性結核組的表達情況 由于引物設計的原因，檢測短片段LncRNA NEAT1-1時，長片段LncRNA NEAT1-1也會被同時檢測到，故NEAT1-2檢測位點可表示2個片段的檢測情況，LncRNA NEAT1-2檢測位點則表示長片段的檢測情況，兩組LncRNA表達情況結果見表1。活動性結核組中短片段LncRNA NEAT1-1的表達明顯增高，且與健康對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；LncRNA NEAT1-2表達與NEAT1-1表達情況類似。見圖2。

表1 LncRNA NEAT1及NEAT1-2檢測結果

圖2 外周血單個核細胞中 LncRNA NEAT1的表達

圖3 外周血單個核細胞中相關炎癥因子的表達

2.2細胞因子IL-6及TNF-α在健康對照組和活動性結核組的表達情況 細胞因子IL-6及TNF-α在健康對照組和活動性結核組的表達結果見表2。結果顯示細胞因子IL-6表達水平升高，與健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；TNF-α在活動性結核組患者中表達上調，與健康對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

2.3短片段LncRNA NEAT1、IL-6及TNF-α用于活動性結核檢測的診斷效能 筆者對LncRNA NEAT1 的2個亞型(長片段LncRNA NEAT1-1、短片段LncRNA NEAT1-2)以及IL-6和TNF-α進行ROC曲線分析。結果表明LncRNA NEAT1-1診斷活動性結核的特異度和靈敏度均為最高，AUC為0.969 7(95%CI0.924 6～1.015)，靈敏度為93.33%，特異度為95.45%，見表3及圖4。

表2 IL-6及TNF-α檢測結果

表3 ROC曲線分析

注：A為IL-6的ROC曲線圖；B為TNF-α的ROC曲線圖；C為LncRNA NEAT1-1的ROC曲線圖；D為LncRNA NEAT1-2的ROC曲線圖。

3 討 論

在結核分枝桿菌引起的機體免疫中，細胞免疫占主導作用，以αβTCRCD4+T細胞為主的T淋巴細胞和巨噬細胞在其中發揮重要作用。T細胞在接受巨噬細胞提呈的已處理抗原后，通過分泌多種細胞因子如干擾素(IFN)、IL、TNF等來放大免疫效應，并以細胞毒作用介導靶細胞的溶解。

參與細胞主要為巨噬細胞與Th1型淋巴細胞，在巨噬細胞吞噬結核桿菌后，經過抗原處理提呈作用與Th1型淋巴細胞識別，激活Th1淋巴細胞后分泌IFN-γ刺激巨噬細胞進一步激活，分泌大量TNF-α等細胞因子募集中性粒細胞參與炎性反應，制約結核分枝桿菌的擴散。同時TNF-α在參與凋亡途徑中死亡配體(TNFR)引起的細胞凋亡中發揮重要作用。短片段LncRNA NEAT1在病毒感染中的表達水平與病毒復制能力相關[8-11]，且由Toll樣受體家族成員(TLR2)介導的在經脂多糖刺激后細胞因子IL-6、TNF-α表達升高的細胞信號通路中，NEAT1作為通路之一發揮作用[12-14]。本研究中，活動性結核組細胞因子IL-6表達水平升高，較健康對照組差異有統計學意義(P<0.05)；TNF-α表達水平上調，與健康正常組相比差異有統計學意義(P<0.01)；NEAT1表達升高，與健康正常組相比差異有統計學意義(P<0.000 1)。進一步證明在活動性結核發展中，細胞因子的表達的確與其發展緊密相關，也提示了NEAT1可作為研究對象來幫助認識機體感染結核病毒后發生細胞免疫的可能調控分子與信號通路。

機體感染結核分枝桿菌后，巨噬細胞被激活用以清除結核分枝桿菌，促進細胞因子IL-6、TNF-α等釋放，增強機體對結核分枝桿菌的殺傷能力，阻止其在體內播散。有研究發現，NEAT1與結核感染過程、結核的發展與轉歸有關，通過一系列信號途徑可影響巨噬細胞內炎癥因子IL-6、TNF-α的表達，從而使機體對抗疾病的能力減低，有助于疾病發展[15]。本研究顯示，在臨床上用于活動性結核的診斷時，對LncRNA NEAT1-1、LncRNA NEAT1-2、IL-6、TNF-α單項指標進行檢測時，LncRNA NEAT1-1的特異度(95.45%)和靈敏度(93.33%)最高。

4 結 論

綜上所述，本研究發現活動性肺結核患者細胞因子IL-6和TNF-α表達水平升高，LncRNA NEAT1表達水平升高最明顯。LncRNA NEAT1在診斷活動性結核時特異度和靈敏度較高，有望作為評估疾病發展和預后的檢測指標。