抗腫瘤藥物體外藥效學評價結合細胞生物學實驗教學促進教研融合

蔡燕飛， 陳 蘊， 史勁松， 金 堅

（江南大學藥學院，江蘇無錫214122）

0 引 言

近年來隨著細胞生物學實驗技術和實驗方法的不斷更新與發展，細胞生物學已經滲透到免疫學、遺傳學、分子生物學和藥理學等生命科學的多個分支學科，并逐漸成為現代生命科學中的一門重要的基礎前沿學科［1-2］。因此，對細胞生物學實驗課程體系的改革和建設是提高細胞生物學實驗教學質量的重要環節。

在例如細胞生物學這類基礎實驗教學中，傳統的驗證性實驗教學已顯現出諸多弊端，嚴重地影響了對學生綜合實驗素質的培養。傳統的基礎實驗教學采取單一、填鴨式的教學方式，且僅傳授給學生一些基本的實驗技能和方法，在培養學生的綜合研究能力方面很少下工夫［3-5］。錢偉長先生曾說，“大學必須拆除教學與科研之間的高墻；教學沒有科研做底蘊，就是一種沒有觀點的教育，沒有靈魂的教育”。因此通過教研結合，將科研內容引入到實驗教學過程中，促進科研與教學的有機結合，這樣不僅可以增加學生對科研知識的學習興趣，同時也有利于理論知識的鞏固，對培養學生的創新能力和實踐能力意義重大。同時，也可以將教學過程中獲得的研究結果轉化到科研成果中，幫助快速推進科研項目進展，兩者相互促進相互補充，一舉多得［6-8］。

為此，結合科研團隊的前期研究成果，設計了以“抗腫瘤藥物的體外藥效學評價”為主題的細胞生物學實驗。以經典的廣譜抗腫瘤藥物阿霉素（Adrimycin，ADM）作為受試藥物，通過MTT 法檢測ADM對乳腺癌MCF-7 細胞、黑色素瘤B16 細胞、肺癌A549 細胞、卵巢癌A2780 細胞和肝癌Bel7402 細胞的半數致死劑量，并運用流式細胞術檢測ADM 對各種細胞的促凋亡能力，從而研究ADM 的抗腫瘤效果［9-13］。通過MTT 染色法測細胞活性是細胞生物學實驗中的基礎實驗，其實驗原理和操作步驟都是常規的，但是單一的實驗方法并不具備一定的創新性，如果通過教研結合，運用通用的實驗方法來解決一定的科研問題，如通過MTT法對化療藥物阿霉素進行體外藥效學評價，通過檢測多種腫瘤細胞對ADM 的藥物敏感性，從而探討ADM的抗腫瘤效果，那么開展該綜合性實驗的意義就大不相同了。同時引入先進的流式細胞技術進一步驗證ADM 的抗腫瘤效果的同時，也激發了學生對于科研的探索和熱情，有助于學生綜合實驗能力的提升。

學生按照2 或3 人1 組，通過自行查閱文獻，確定藥物作用濃度，設計合理的實驗方案，實驗前期老師與學生開展一次討論會，評估各組實驗方案的科學性和可行性，并最終確定詳細的實驗方案。實驗結束后，教師收集各組學生的統計實驗結果，然后將所有數據發給每組學生，各組將全班數據進行統計分析，并最后得出結論，提交實驗報告，最后以PPT 的形式分享實驗結果和實驗心得，并對該課程進行評價。

1 實驗目的和原理

抗腫瘤藥物的體外藥效學研究，就是利用細胞培養技術，根據不同原理測定藥物的抗腫瘤作用，例如通過腫瘤細胞活性檢測、凋亡相關蛋白酶活性檢測、亞細胞形態改變等途徑鑒定藥物的抗腫瘤效果。本實驗通過經典的MTT染色法檢測5 種不同來源的實體瘤細胞對ADM的敏感性，包括乳腺癌MCF-7 細胞、黑色素瘤B16 細胞、肺癌A549 細胞、胃癌A2780 細胞和肝癌Bel7402 細胞，并運用流式細胞術進一步檢測ADM 對各種細胞的促凋亡能力，從而研究ADM 的抗腫瘤效果［14-15］。

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。MTT溶解液能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490 nm 波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比，MTT染色法是最經典的用于檢測體外細胞活性的方法。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂膜內側翻向外側。Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。將Annexin V進行熒光素（FITC）標記，以標記了的Annexin V 作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，通過流式細胞技術就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來［16-17］。

2 實驗材料

2.1 細胞株

乳腺癌MCF-7 細胞、黑色素瘤B16 細胞、肺癌A549 細胞、卵巢癌A2780 細胞和肝癌細胞Bel7402 均來自江南大學藥學院科研實驗室，原始細胞均購自中科院上海細胞庫。

2.2 主要試劑

胎牛血清和DMEM 培養液均購自Gibco 公司；PBS、青霉素鏈霉素溶液和胰蛋白酶均購自Hyclone公司；臺盼藍染色液、MTT 染色液和細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術研究所。

2.3 主要儀器

二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、細胞計數儀、酶標儀、流式細胞儀等。

3 實驗方法

3.1 細胞培養

5 種細胞均培養于含10% FBS 的DMEM 完全培養液中，其中MCF-7 細胞中需額外添加10 μg ／ mL的胰島素，細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內常規培養，0． 25%胰酶消化傳代。

3.2 MTT染色法測細胞活性

（1）細胞按照7 000 個／孔、每孔100 μL 鋪96孔板；

（2）培養過夜后，吸去上清液，按照設置的藥物濃度梯度加藥，每孔100 μL；

（3）藥物作用72 h后，每孔加10 μL 5 mg ／ mL的MTT溶液，繼續培養4 h；

（4）棄上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，搖床振蕩10 min，使結晶充分溶解；

（5）用酶標儀在490 nm波長處測定其光吸收值；

（6）根據吸光值計算細胞活率，運用Prism軟件，以藥物濃度的lg值為橫坐標，細胞活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，計算IC50 值。

3.3 Annexin V聯合PI染色法檢測細胞凋亡

（1）藥物作用48 h后，消化細胞并計數，取1． 0 ×106個細胞離心，棄上清。

（2）用提前預冷的PBS 清洗兩遍，棄上清，再加入1 mL 1 × Binding Buffer，細胞重懸。

（3）從上述懸液中取100 μL 細胞懸液加入1． 5 mL離心管，避光條件下，先加入5 μL FITC染料，再加入5 μL PI染料，常溫避光孵育15 min。

（4）加入400 μL 1 × Binding Buffer 進行稀釋，在1 h內將樣品在流式細胞儀中進行檢測。

（5）運用Flow J軟件進行數據分析。

3.4 數據統計

全部實驗數據經Graph Pad Prism5 進行統計學分析，結果以ˉx ± s 表示，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

4 實驗結果與討論

4.1 MTT染色法檢測腫瘤細胞對ADM的敏感性

將一個自然班按照2 或3 人／組進行分組，共15組，每3 組選擇一種腫瘤細胞進行實驗。實驗前期，學生自行調研文獻，制定詳細的實驗方案，在經過與老師討論后確定最終的實驗方案。在MTT實驗過程中，學生根據調研自行設計藥物作用濃度梯度，計算好稀釋方法。圖1 所示為其中一組的MTT實驗結果，結果表明，隨著ADM藥物濃度的升高，人乳腺癌MCF-7 細胞的活率逐漸下降，該組藥物濃度設置較為合理，基本覆蓋了完全抑制到無抑制效果的全過程，擬合的曲線呈S型，經計算ADM對人乳腺癌MCF-7 細胞的IC50 為0． 15 μmol／ L。表1 所示為將15 組實驗進行統計的結果，表明ADM具有明顯的廣譜抗腫瘤效果，對5 種不同的腫瘤細胞均具有一定的抑制作用，其中乳腺癌MCF-7 細胞對ADM 最為敏感，其IC50 值小于1． 0 μmol／ L，肝癌Bel7402 細胞對ADM最不敏感，其IC50值大于10 μmol／ L。

圖1 MTT法檢測人乳腺癌MCF-7細胞對ADM的敏感性

表1 5 種不同的腫瘤細胞對ADM的藥敏性檢測（ˉx ± s，n ＝3）

4.2 流式細胞術檢測ADM的促凋亡能力

運用Annexin V 聯合PI染色法檢測ADM的促凋亡能力。根據MTT 實驗的統計結果，選擇3 μmol／ L濃度的ADM作用于各種腫瘤細胞，48 h 后檢測細胞的凋亡情況。圖2 所示為其中一組的流式圖，結果顯示3 μmol／ L 的ADM 作用于乳腺癌MCF-7 細胞48 h后，活細胞比例為0． 73%，壞死細胞比例為10． 1%，早期凋亡細胞比例為1． 72%，晚期細胞凋亡比例為87． 5%。將15 組實驗進行統計，結果如表2 所示。結果顯示，3 μmol／ L 的ADM 使約90%的乳腺癌MCF-7細胞發生凋亡，約50%左右的黑色素瘤B16 細胞和卵巢癌A2780 細胞發生凋亡，約20%左右的肺癌A549細胞發生凋亡，肝癌Bel7402細胞幾乎不發生凋亡，該實驗結果與藥敏性實驗結果相吻合，進一步驗證了ADM具有廣譜的抗腫瘤藥效果，但是對于不同來源的腫瘤其抗腫瘤效果有所差異，對乳腺癌MCF-7 細胞最為敏感，對肝癌Bel7402 細胞的敏感性較差。

圖2 ADM對人乳腺癌MCF-7細胞的促凋亡能力檢測

表2 ADM對5 種不同腫瘤細胞的促凋亡能力檢測（ˉx ± s，n ＝3）

5 結 語

通過經典的MTT 染色法檢測5 種不同來源的實體瘤細胞對ADM 的敏感性，并運用流式細胞術進一步檢測ADM 對各種細胞的促凋亡能力，從而研究ADM的抗腫瘤效果。整個實驗過程中，學生通過文獻調研了解了抗腫瘤藥物抗腫瘤活性研究的基本方法和原理，通過細胞活性和細胞凋亡檢測，學生掌握了細胞培養的基本實驗操作技能，熟悉了倒置顯微鏡、離心機等簡單儀器的使用方法，了解了酶標儀、流式細胞儀等自動化儀器的檢測方法，經過實驗設計、實驗實施、數據統計及分析一系列連貫的鍛煉，學生的整體實驗操作能力、分析問題和解決問題的能力、科研創新能力均有了很大提升。

從課程實施和學生反饋結果來看，仍有以下幾個方面可以持續改進：①課程內容需隨著科研進展進一步加深和完善。本科實驗教學項目應與學科前沿的步調相一致，脫離科研的實驗教學已無法達到現代人才培養的要求；②持續改進教學方式。開放式教學是目前綜合實驗教學的新型教學模式，但其具體的方式方法還不夠成熟，還需要進一步摸索和改進；③實驗設施不斷完善。及時更新換代科學儀器設備，緊跟時代發展的步伐；④優化師資結構。當代細胞生物學已滲透到多個分支學科，因此對于指導教師的專業要求也隨之改變，對于類似綜合性的實驗課程，指導教師的專業要求需更加廣泛。